microRNA標的特異性の評価：合成microRNAミミックを用いたウイルス拡散アッセイ 注：microRNAとmicroRNA標的の相互作用の特異性を示すために、合成microRNAミミックを使用します。microRNA介在性の毒性を評価するために、すべてのアッセイにおいて、モック導入、ネガティブコントロールmicroRNAミミック、および実験用microRNAミミックのみのコントロールを含めてください。また、microRNAミミックの導入効率が低いと偽陰性となる可能性があるため、ポジティブコントロール（すなわち、microRNA標的遺伝子またはゲノム）を含めることが理想的です。 導入時にコンフルエンスが80〜90%になるように、H1-HeLa細胞を96ウェル組織培養プレートに播種します（播種後24時間）。10%胎児牛血清を添加したDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）を1ウェルあたり0.1 mLで播種します。 注：このアッセイは、対応するmicroRNAを発現していない、ウイルス複製が可能な細胞で行ってください。 導入試薬を室温に戻します。9 µLの無血清培地、1ウェルあたりの最終濃度200 nMのmicroRNAミミックストック溶液、0.18 µLのブースト試薬、0.18 µLの導入試薬を合わせ、混合します。混合物を室温で2〜5分間インキュベートします。 注：記載されている容量は1ウェルあたりです。一貫性を維持し、ピペッティングエラーを最小限に抑えるため、全ウェルの導入用にマスターミックスを作成することを推奨します。microRNAミミックの最適濃度は異なります。適切な開始濃度については、microRNAミミックに付属する製造者の指示書を参照してください。一般的に、最終濃度は5〜200 nMの範囲となります。 ウェルから培地を吸引し、92 µLの新鮮な完全培地を加えます。 注：サンプル数が多い場合は、導入溶液を調製する前にこの手順を完了させ、準備が整うまでプレートを37 °Cで保存してください。 導入混合物すべてを、細胞に滴下するように加えます。 37 °Cで6時間インキュベートします。 ウイルスの拡散を解析できるよう、感染する細胞の割合が低くなるように、低いMOI（感染多重度）で各ウェルを感染させます。本プロトコルでは、MOI 0.2を使用します。 ウイルスストックを無血清培地で希釈し、100 µLあたりMOI = 0.2の濃度にします。ウェルから培地を取り除き、1ウェルあたり100 µLのウイルス希釈液を加えます。 37 °Cで2時間インキュベートします。 各ウェルから培地を吸引し、100 µLの新鮮な完全培地を加えます。 37 °Cで20〜22時間インキュベートします。 上清中のウイルス力価を決定します。 各ウェルから上清を回収し、100 µLの新鮮な完全培地と交換します。 注：浮遊細胞を使用する場合は、次ステップで得られた細胞ペレットを100 µLの新鮮な完全培地で再懸濁し、生存率アッセイのためにサンプルウェルに戻してください。 回収した上清を4 °C、300 x gで5分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。 清澄化した上清を新しいチューブに移し、対応するmicroRNAを発現していない許容性細胞を用いて感染性ウイルスの力価を測定します。 注：感染性の低下を防ぐため、すべてのサンプルを氷上で保持してください。 Ruiz, A. J. および Russell, S. J. ピコルナウイルスの向性のmicroRNAによる調節。 J. Vis. Exp. (2017)
このビデオでは、合成microRNAミミックを用いて、培養された上皮様細胞におけるウイルス複製を選択的に抑制する方法を実演します。microRNAによるゲノムサイレンシングがウイルスの拡散をどのように阻止するかを示し、その後の感染性解析を通じてターゲティングの特異性を確認する方法について解説します。
