免疫刺激タンパク質をコードする組換え麻疹ウイルスの作製

要約

出典：Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019) Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. 腫瘍標的免疫調節のためのパラミクソウイルス：設計およびex vivo評価。 J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、リポソームを用いて、ウイルスのアンチゲノムおよび必須ヘルパータンパク質をコードするプラスミドを生産細胞に導入し、組換え麻疹ウイルスを作製する方法を解説します。転写および複製されたRNAにより、免疫刺激タンパク質および蛍光レポータータンパク質を発現するウイルス粒子が形成されます。その後、蛍光顕微鏡を用いてシンシチウム（細胞融合体）の形成を可視化し、組換えウイルスの作製が成功したことを確認します。

プロトコル

注記： [O]、[P]、[M]は、それぞれオンコリティックウイルス（OV）全般、(大部分の) パラミクソウイルス、または麻疹ウイルス（MV）のみに適用されるサブセクションであることを示します。[B]は、二重特異性T細胞誘導抗体（BTE）導入遺伝子に特有のセクションであることを示します。

1 免疫調節因子をコードするトランスジェンの麻疹ウイルスベクターへのクローニング

1. [O] インサート配列の設計。
   1. [O] 文献調査や遺伝学的スクリーニングなどの探索的データに基づき、目的の免疫調節剤を決定し、GenBank、European Nucleotide Archive、または国際免疫遺伝学情報システム（IMGT）などの適切なデータベースから、関連する相補的DNA（cDNA）配列を抽出する。
   2. [O] トランスジーン配列にさらなる機能を追加する（図1）。上流にKozak配列を配置し、種特異的なコドン最適化を行うことで、発現量を高めることができる。分泌させるにはシグナル配列が必要である。検出および精製のために、N末端および/またはC末端のタンパクタグをコードする配列を組み込む。ベクターに挿入するための制限酵素部位を含める。
      注意： 組換え麻疹ウイルス（MV）ゲノムから外来遺伝子を発現させるには、MVポリメラーゼの遺伝子開始および停止シグナルを持つ追加転写単位（ATU）が必要です。サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターで制御され、定義された位置に正鎖外来遺伝子を導入するためのユニークな制限酵素部位を持つATUを含む、適切なアンチゲノムcDNAベクターが以前に開発されています。パラミクソウイルスに特有の発現勾配により、外来遺伝子の配置はウイルスの複製および外来遺伝子の発現に影響するため、適切な位置への配置が極めて重要です。アンチゲノムの3'末端に近いATU（すなわち、リーダー位置またはP遺伝子の下流）への導入は、一般にウイルスの複製が減少する一方で、高い外来遺伝子発現をもたらします。H遺伝子の下流のATUを使用すると、複製の増加と外来遺伝子発現レベルの低下が予想されます。麻疹ウイルスを含むいくつかのパラミクソウイルスのゲノムパッケージングには、各ヌクレオカプシドタンパク質による6つのヌクレオチドの結合が必要です。これらのウイルスに外来遺伝子を挿入する場合は、全ゲノムのヌクレオチド数が6で割り切れることを確認してください。これは、以下のようにも呼ばれます。 "6つの法則"必要に応じて、フレームシフトや未熟終止コドンを導入することなく、インサート（Kozak配列の上流または終止コドンの下流）に追加のヌクレオチドを挿入してください。[M] トランスジェーンにおいて、MVの遺伝子開始シグナル（AGGRNCMARGW）および終止シグナル（RTTAWANAAAA）、ならびにRNA編集配列（AAAAAGGG）に類似した特定の配列が含まれないようにしてください。
   3. [O] 希望する配列のオリゴヌクレオチドを購入するか、あるいは標準的な分子クローニングを用いて利用可能な配列から組み立てる。
      注： [O] トランスジェンのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のため、上流の制限酵素部位とインサートの最初の15〜20ヌクレオチドを含むフォワードプライマーと、インサートの最後の15〜20ヌクレオチドに続いて下流の制限酵素部位を含むリバースプライマーを設計する。
2. [O] ウイルス（アンチ）ゲノムをコードするDNAにインサートをクローニングする。
   1. 標準的な分子クローニング手法（すなわち、酵素による制限処理およびそれに続くDNAライゲーション）を用いて、インサートをDNAベクターまたはRNAウイルスのDNAアンチゲノムにクローニングする。
      1. [O] 非互換の制限酵素部位を使用するか、またはライゲーション前に脱リン酸化を行うことで、ベクターの再ライゲーションを防止する。
      2. [O] アガロースゲル電気泳動によりライゲーション産物を分離し、市販のキットを用いてゲル精製を行う。一般的に、インサートとベクターのモル比を3:1に設定することで、最適なライゲーション効率が得られる。
   2. [O] ライゲーション産物を、大型プラスミドを効率的に回収するのに適したコンピテント細胞に形質転換する（すなわち、以下の操作でヒートショックを行う）。 E. coli）および、コロニーPCRにより、目的のDNAを保持する細菌クローンを同定する。
   3. [O] 市販のDNA調製キットを用いて、単一の細菌クローンから増幅DNAを単離する。適切な制限酵素（例： 後方MVゲノム［M］に対するIII。シーケンシングにより、導入遺伝子が正しく挿入されており、完全性が保持されていることを確認する。
      注： [M] MV H-ATUに挿入したトランスジーンについて、以下のプライマーを用いてサンガーシーケンシングを行う：H-9018［フォワードプライマー、Hオープンリーディングフレーム（ORF）のMVゲノムポジション9018に結合］：5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'；L-9249+（リバースプライマー、L ORFのMVゲノムポジション9249に結合）：5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'。

2. 免疫調節因子をコードする組換え麻疹ウイルス粒子のレスキュー

1. [O] 各ウイルスの標準プロトコルに従い、ウイルス産生細胞へのトランスフェクションを通じて、（アンチ）ゲノムDNAから組換えウイルス粒子を生成する。無菌条件下での操作ガイドラインに従うこと。細胞培養はフード内で行い、特にウイルスを扱うすべての工程はクラスIIバイオセーフティキャビネット内で実施する。
   1. [M] cDNAからの麻疹ウイルスのレスキューには、トランスフェクションの24時間前にMV産生細胞（アフリカミドリザル腎由来Vero細胞）を6ウェルプレートに均一に播種する。トランスフェクション時にコンフルエンシーが65～75%になるよう、1ウェルあたり2 mLの10%胎児牛血清（FBS）含有Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）に2 x 10⁵ cellsを播種する。
      注記： [P] ウイルス誘発性のシンシチウム形成前に細胞が過成長した場合は、細胞数を減らすこと。
   2. [P] ウイルスアンチゲノム、必要なヘルパープラスミド、および（必要に応じて）トランスフェクション効率を評価するための蛍光リポーターをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションする。
      1. [M] 麻疹ウイルスアンチゲノムをコードする組換えDNA 5 µg、麻疹ウイルスNタンパク質およびLタンパク質をコードする哺乳類発現プラスミド各500 ng、およびPタンパク質をコードするプラスミド各100 ngを、合計200 µLのDMEM中で混合する。トランスフェクション効率の評価が必要な場合（かつ、ウイルスのアンチゲノム構築物内にすでに含まれていない場合）は、蛍光リポータープラスミド 100 ngを加える。
      2. リポソームトランスフェクション試薬 18.6 µLを加え、直ちにチューブを軽く叩いて混ぜ、室温（RT）で25分間インキュベートする。
      3. [P] 培地を1ウェルあたり1.8 mLのDMEM（2% FBS、50 µg/mLカナマイシン、または汚染防止用の他の抗生物質含有）に交換し、トランスフェクション混合液をウェルに滴下し、慎重に旋回混和する。細胞を37 °C、5% CO₂でオーバーナイトでインキュベートする。翌日、培地を2 mLの新鮮なDMEM（2% FBS、50 µg/mLカナマイシン含有）に交換し、培地が酸性になった際にこれを繰り返す。
         注意： [O] トランスフェクションから以降の工程までウイルスが存在する可能性があるため、バイオセーフティ規定に従って細胞および材料を扱うこと。（潜在的な）感染性廃棄物は適切に処理すること。

結果

図1：麻疹ウイルスゲノムの模式図。リーダー（ld）配列の下流にある追加の転写単位に、強化緑色蛍光タンパク質（eGFP）がコードされている。N、P、M、F、H、およびLは、それぞれ麻疹ウイルスの構造タンパク質であるヌクレオカプシドタンパク質、Pタンパク質、マトリックスタンパク質、融合タンパク質、ヘマグルチニンタンパク質、およびラージタンパク質（ポリメラーゼ）をコードする遺伝子を示しており、上記のように分化的に発現している。二特異性T細胞誘導分子（BTE）導入遺伝子が、Hオープンリーディングフレームの下流にある追加転写単位（ATU）に挿入されている。この導入遺伝子は、効率的な分泌のための免疫グロブリンカッパ（Igκ）リーダーペプチドに加え、検出および精製のためのインフルエンザヘマグルチニン（HA）およびヘキサヒスチジン（His）タンパク質タグをコードしている。CD3およびCD20をそれぞれ標的とする抗体の可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）ドメインをコードする遺伝子は、グリシン（G）およびセリン（S）残基を含むペプチドリンカー配列viaで接続されている。導入遺伝子配列の前にはKozak配列が配置されている。コード領域の下流には、「6の倍数ルール（rule of six）」に準拠するための例として、追加のヌクレオチドが含まれている。挿入カセットは2つの制限酵素部位に挟まれており、これにより各ATUへの挿入が可能となっている。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit	Roche Life Science, Mannheim, Germany	4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit	Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot	K1231
アガロース	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN, Hilden, Germany	28704
NEB 10-beta コンピテント E. coli	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany	C3019I
QIAquick Miniprep Kit	QIAGEN, Hilden, Germany	27104
制限酵素 HindIII-HF	New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany	R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021
ウシ胎児血清 (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500
FugeneHD	Promega, Mannheim, Germany	E2311	任意のトランスフェクション試薬で代用可能
カナマイシン	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	K0129
Vero細胞	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81
6ウェルプレート	Neolab, Heidelberg, Germany	353046