治療用ウイルス産生上皮細胞の作製および回収

要約

免疫調節因子をコードするウイルスベクターの複製能および細胞毒性能の決定 作製した組換えウイルスと未修飾のベクターの複製キネティクスを、ワンステップまたはマルチステップの増殖曲線（GC）を用いて比較する。ワンステップGCでは、すべての細胞を同時に感染（理論的に100%感染）させた後、子ウイルスを評価する。マルチステップGCでは、低濃度の感染細胞から開始し、数回のウイルス複製ラウンドを追跡する。 麻疹ウイルスの複製キネティクスを解析する場合、感染の前日に、12ウェルプレートの各ウェルに1 x 10⁵個のVero細胞を、10% FBS（ウシ胎児血清）含有DMEM（ダルコ・ modified eagle medium）1 mLで播種する。関心のある各タイムポイントにつき、テクニカルレプリケートとして少なくとも2ウェルをプレートする。 Vero細胞での複製において、マルチステップGCの場合は低MOI（感染多重度）、ワンステップGCの場合は高MOI（MVまたは麻疹ウイルスの場合は、それぞれ0.03および3）で細胞を感染させる。培地を、所定量のウイルスを含む300 µLの無血清培地に交換し、37 °C、5% CO₂で少なくとも2時間インキュベートする。接種液を除去し、10% FBS含有DMEM 1 mLを加え、インキュベーションを継続する。 感染後12、24、36、48、72、96時間などの適切なタイムポイントで、細胞を培地中に直接スクレイピングして子ウイルスを回収する。各ウェルの内容物を個別のチューブに移し、液体窒素で急冷し、タイター測定まで-80 °Cで保存する。 注：平均タイターを解析するために、このステップでレプリケートサンプルをプールしてもよい。 すべてのタイムポイントからサンプルを回収する。子ウイルスを評価するため、37 °Cで同時に融解させる。ボルテックス後、2,500 x g、4 °Cで5分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化する。 上記のように、各コンストラクトおよびタイムポイントの平均タイターを算出する。タイターを時間経過に対してプロットする。トランスジェンを挿入したベクターと挿入していないベクター、異なるトランスジェンを持つベクター、または異なる位置にトランスジェンを挿入したベクターの増殖曲線を比較する（図1参照）。 Heidbuechel, J. P., 他腫瘍標的型免疫調節のためのパラミクソウイルス：ex vivoにおける設計と評価 J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、ウイルス複製を研究するために、遺伝子組換えウイルスを腎上皮細胞に感染させてウイルスを産生し、回収するプロセスを解説します。

プロトコル

1. 免疫調節因子をコードするウイルスベクターの複製能および細胞毒性の評価

作製した組み換えウイルスと未修飾ベクターの複製キネティクスを、1ステップまたはマルチステップの増殖曲線（GCs）を用いて比較します。1ステップGCでは、すべての細胞を同時に感染させた後（理論的には100%感染）に、ウイルス子孫を評価します。マルチステップGCでは、感染細胞の割合を低く設定して開始し、数回のウイルス複製サイクルを追跡します。

1. 麻疹ウイルスの複製キネティクスを解析するため、感染の1日前に、12ウェルプレートの1ウェルあたり1 mLの10% FBS（胎児牛血清）含有DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）に1 x 10⁵ 個のVero細胞を播種する。各測定時点で、テクニカルリプリケートとして少なくとも2ウェルを用意する。
2. Vero細胞への複製において、マルチステップ増殖曲線（GC）の場合は低MOI（感染多重度）、ワンステップGCの場合は高MOI（麻疹ウイルス（MV）の場合はそれぞれ0.03および3）で細胞にウイルスを感染させる。培地を、規定量のウイルスを含む300 µLの無血清培地に交換し、37 °C、5% CO₂で少なくとも2時間インキュベートする。接種液を除去し、10% FBS含有DMEM 1 mLを添加して、インキュベートを継続する。
3. 感染後12、24、36、48、72、96時間などの適切な時点で、細胞を培地中に直接スクレイピングして子ウイルスを回収する。各ウェルの内容物を個別のチューブに移し、液体窒素で急速凍結させ、タイター測定まで-80 °Cで保存する。
   注：平均タイターを解析するため、このステップでリプリケートサンプルをプールしてもよい。
4. すべての時点のサンプルを回収する。子ウイルスを評価するため、37 °Cで同時に融解させる。ボルテックス後、4 °C、2,500 x gで5分間遠心分離して細胞残渣をペレット化する。
5. 上述の方法で、各構築物および時点の平均タイターを算出する。タイターの時間経過をプロットする。外来遺伝子の挿入有無、異なる外来遺伝子の使用、または外来遺伝子の挿入位置が異なるベクター間で増殖曲線を比較する（Figure 1を参照）。

結果

図1：組換え麻疹ウイルスの複製キネティクスおよび溶細胞活性。 (A) 未修飾の腫瘍溶解性麻疹ウイルス（MV）または二重特異性T細胞誘導因子をコードする麻疹ウイルス（MV-H-mCD3xhCD20）をMOI 1でVero細胞に感染させ、1ステップ増殖曲線を 作成した。感染後の指定したタイムポイントでウイルス子粒子のタイターを評価したところ、同様のウイルス複製キネティクスが示された。8つのサンプル（各タイムポイントにつき、2つの生物学的レプリケートにつき4つのテクニカルレプリケート）の平均値と標準偏差を示す。 (B) ヒト癌胎児性抗原およびMV受容体CD46を安定発現させたマウス大腸がん細胞（MC38-CEA-CD46）に対し、培地のみ（mock）または指定したウイルスをMOI 1で接種し、細胞生存率を評価した。指定したタイムポイントでXTT細胞生存率アッセイを実施した。未修飾ベクターでは、より早いタイムポイントで細胞生存率の低下が観察された。MV-H-mCD3xhCD20の12時間時点の計算値に見られるような100%を超える値は、感染直後に頻繁に観察され、これは細胞ストレスやウイルス懸濁液中に存在する細胞由来因子による可能性がある。各タイムポイントについて、3つのテクニカルレプリケートの平均値と標準偏差を示す。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen, Darmstadt, Germany	31966-021	Vero細胞の播種および感染に使用
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biosera, Boussens, France	FB-1280/500	DMEMの添加用
Vero cells	ATCC, Manassas, VA, USA	CCL81	麻疹ウイルスの増殖およびアッセイ用の宿主細胞
12-well plates	Neolab, Heidelberg, Germany	353043	Vero細胞の播種用（1 × 10⁵ cells/well）
Opti-MEM (serum-free medium)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	31985070	ウイルス感染ステップ用（無血清培養）
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany	14190-094	洗浄および培地調製用
Cell lifter	Corning, Reynosa, Mexico	3008	回収時の感染細胞の掻き出し用
50 mL tubes	nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany	02-572-3001	サンプル回収および遠心分離用
Liquid nitrogen	—	—	回収したウイルスサンプルの急速凍結用
Centrifuge (capable of 2,500 × g)	—	—	細胞残渣のペレット化用
XTT Cell Viability Kit (Colorimetric Cell Viability Kit III)	PromoKine, Heidelberg, Germany	PK-CA20-300-1000	XTT試薬を含む；細胞毒性測定用
96-well plates, flat-bottom	Neolab, Heidelberg, Germany	353072	450 nmでの吸光度測定用
Spectrophotometer / Microplate reader	—	—	450 nmでの光学吸光度測定用（参照波長 630 nm）
Carbon dioxide incubator	—	—	すべての細胞培養における 37 °C, 5% CO₂ 設定用