分離した免疫調節因子の免疫機能性を評価する。以下に、乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイを用いて、二特異性T細胞誘導因子（BTE）による細胞媒介細胞毒性を評価する方法を詳細に述べる。 実験で検証する条件を決定する（例として図1を参照）。タイムポイント（時間～日）、免疫調節因子の濃度（pg/mL～µg/mL）、およびエフェクター細胞対ターゲット細胞比（E:T比、例えば1:50から50:1の間）を変更可能である。サンプルは常に3連（triplicate）で調製する。 BTEタンパク質およびエフェクター細胞を含まないサンプル、単一細胞種（TspおよびEsp）の自発的LDH放出コントロール、読み取り前に界面活性剤を添加したターゲット細胞の最大溶解コントロール（Tmax）、培地のみのコントロール、およびTmaxの容量コントロールを含める。 注意：必要なターゲット細胞数およびインキュベーション時間は変動する場合がある。最適なパラメータを特定するため、エフェクター細胞と免疫調節因子を含まない予備試験を行う。異なる細胞数とタイムポイントを評価するため、TspおよびTmaxサンプルと対応するコントロールを含める。 免疫エフェクター細胞を分離する（例：ヒト血液の密度勾配遠心法による末梢血単核球（PBMC）の取得、またはマウス脾細胞からのマウスT細胞のネガティブセレクション）。 ターゲット細胞（例：1ウェルあたり5 x 10³個）をU底96ウェルプレートに播種する。 所望の濃度の分離タンパク質を各サンプルに添加する。所望の比率で免疫エフェクター細胞を添加する。1ウェルあたりの全量が100 µLになるように培地を添加する。 決定した期間（通常は4～48時間。未刺激のPBMCの場合は24時間、新鮮に分離したマウスT細胞の場合は48時間。事前刺激した免疫細胞の場合はより短いインキュベーション時間を適用できる）、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートする。 サンプル回収の45分前に、Tmaxサンプルおよび対応する培地コントロールを含むウェルに10x溶解溶液を10 µL添加する。インキュベーションを継続する。 250 x gで4分間遠心分離し、細胞を沈殿させる。各上清から50 µLを平底96ウェルプレートに転写する。細胞結合性のLDHを避けるため、細胞は転写しない。 製造元の指示に従って基質溶液を調製する。各ウェルに50 µL添加し、室温［RT］、暗所で30分間、またはTmaxサンプルが深赤色になるまでインキュベートする。 各ウェルに50 µLの停止液を添加する。4,000 x gで1分間の遠心分離および中空針による手動操作で気泡を除去する。490 nmで光学的吸光度を測定する。 各サンプルの特異的溶解率（% specific lysis）を算出する。 溶解溶液ありおよびなしの培地コントロールの繰り返し試行の平均値を算出する。得られた値を実験サンプル、ならびにTmaxおよび自発的放出コントロールからそれぞれ差し引く。これらのバックグラウンド補正後の値を以降の計算に使用する。 バックグラウンド補正後のTmax、Tsp、およびEspコントロールの平均値を算出する。これらの平均値を用いて、以下の式により各サンプルの特異的溶解率を求める。 特異的溶解率をタンパク質濃度またはE:T比に対してプロットし、非標的コントロールサンプルと比較する。 Heidbuechel, J. P., 他腫瘍標的免疫調節のためのパラミクソウイルス：設計およびex vivo評価。 J. Vis. Exp. (2019).
このビデオでは、ウイルスにコード化された二重特異性T細胞誘導因子（BTE）の標的特異的な免疫調節活性を評価するための細胞ベースのアッセイを紹介します。BTEは、標的受容体を発現している腫瘍細胞とT細胞を結合させ、腫瘍の溶解と酵素の放出を誘発します。基質の変換に基づく比色読み取りにより、T細胞の活性化が示されます。試験サンプルの色強度がより高い場合、BTEを介した受容体特異的な免疫エンゲージメントが確認されます。
