ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

Summary

技術、プロトコル、および高収率で接着細胞の培養に使用コーニングHYPERStack船と付属品の取り扱いへの導入。プロトコルは、現在のスタック板製品を介して細胞の回収を増加させるための閉鎖系容器を使用する方法について説明します。

Abstract

マイクロビーズが最適な選択ではない場合、大容量接着細胞培養は、現在スタックプレートの細胞増殖製品の標準化されています。 HYPERStack船は、現在のスタックプレート製品からのクローズドシステムのスケールアップが可能と同じ体積のフットプリントで、> 2.5倍以上のセルを実現。 HYPERStack船ガス交換が発生することができるガス透過性材料を介して関数は、したがって、容器内の内部ヘッドスペースが不要になります。ヘッドスペースの除去は細胞増殖を最小限にするために発生するコンパートメントは、同じ体積のフットプリント内で細胞増殖の表面積の複数の層をできるように、スペースを減らすことができます。

このような細胞療法やワクチンの生産などの多くのアプリケーションでは、クローズドシステムは、細胞の成長と収穫のために必要です。 HYPERStack容器は、メディアの袋または他の方法からチューブを介して細胞と試薬の追加および削除することができます。

このプロトコルは、細胞、クローズドシステムの細胞増殖のプロトコル、および様々な収穫方法の代謝のニーズを満たすためにHYPERStack船、ガスの拡散の結果で使用されるガス透過性材料の背後にある技術について説明します。

Protocol

1。 HYPERStack容器 - ガス透過性材料技術の背景

1. HYPERStack容器は、細胞代謝のために76.2micronガス透過性高分子膜を介してガス交換に依存している細胞の閉鎖系培養のための多層容器です。
2. HYPERStack容器は、容器内の細胞を上記の"ヘッドスペース"を持っていないという点で、従来の細胞培養容器とは異なります。むしろ容器内のガス交換のためのこの"ヘッド"を含むより、ガス透過性の製品は大気に開放されている各培養チャンバーの下に空気のスペースを（"気管"のスペースと呼ばれる）がある。
3. この気管スペースは、同等のガス交換を持っている容器の各細胞培養室で増殖する細胞を可能にします。
4. ガス透過性フィルムは、無菌環境を維持しながら、ガス交換が発生することができます。複数の層のそれぞれについて、すべての流体の操作は、単一のエントリのポートを介して行われる。

2。 HYPERStackの船舶のコンポーネントの概要

1. Stacketteは、トッププレートとガス透過膜で構成されている個々の細胞培養のコンパートメントです。細胞は、このコンパートメント内で培養される。
2. 液体マニホールドはHYPERStackモジュール内で一緒に12 stacketteの層のそれぞれを接続します。モジュールは、12層の倍数で血管を形成するために配管で接続されています。マニホールドは、ユーザーが全体の容器に一つの流体操作を行うことができます。
3. エアマニホールドはまた一緒にstacketteの層を接続しますが、それは流体の追加が発生したときに容器から空気を置換するために使用。それは、充填時に使用する上限ラインが含まれています。
4. 気管スペースには、ガス交換は、各レイヤー"ガス透過膜を介して行うことが可能なため、各stackette層との間にオープンエアの空間です。
5. 液体ハンドリングチューブを液体マニホールドに接続され、すべてのクロー​​ズドシステムの流体操作を行うために使用されます。このコンポーネントは、カスタマイズすることができます。
6. ベントチューブは、空気マニホールドに接続してエアフィルタが含まれており、無菌性を維持しながら、余分な空気を解放するために使用されています。
7. チェースチューブは、フィルタとクランプがあり、液体ハンドリングのチューブに接続されており、容器に充填した後、液体ハンドリングチューブからの流体を排気するために使用されます。
8. コー​​ニングのスタックマニピュレータまたはCSMは、使用中に正しい位置に船を置くことを支援するためのハンドリング装置です。
9. 充填ウェッジは、手動でHYPERStack容器に充填する際に使用するステンレス鋼アシストです。

3。 HYPERStackの船舶に使用されるガス透過膜を介してガスの拡散の結果

1. ベントヘッドスペースと伝統的な細胞増殖のシステムでは、メディア内の酸素は、培養の3日間で50％の平均を消耗しています。 （図1）
2. 同じ細胞増殖システムでは、メディア3mmの高さで酸素勾配は、細胞層にあるよりも、ヘッドスペースの接合部へのメディアではほぼ50％大きくなります。 （図2）
3. 76.2micronのガス透過性のポリスチレン膜を介して酸素の拡散は、メディアの2.6ミリメートルを介して拡散に等しいです。 HYPERStack船で使用されるガス透過膜は、ガス交換は、細胞層で発生することができます。
4. 細胞がコンフルエントに成長するにつれてHYPERStack船の気管空間における酸素の％は一定に保たれます。 （図3）

4。メディアバッグの準備

1. HYPERStack - 12層の血管は、メディアの1.3Lを受け取り、HYPERStack - 36層の血管は、メディアの3.9Lを取ります。
2. 前に袋詰めメディアを接種するために血清を使用する場合、チューブはメディアの袋に血清袋を溶接してよく混ぜる。
3. 大きなバッグのクランプを使用してバッグ内のメディアの約300 mLをオフクランプ。これは、すべての接種した細胞を充填し、どれもメディアの袋に残っていない時に使用されるようになります。袋のスタンドにメディアの袋を置きます。

5。接種メディア

1. 細胞懸濁液を取り付けたチューブと注射器を埋める。チューブ溶接3 / 16"メディアのバッグに細胞懸濁液を含む注射器からチューブ。
2. メディアのバッグに細胞懸濁液を注入し、よく混合する。

6。手順を埋める

1. チューブはHYPERStack容器の3 / 8"液体ハンドリングのチューブに接種したメディアの袋を溶接。（無菌接続するか、多目的で接続する（MPCは）を使用して、また容器へのメディアの袋を添付することができます）。
2. HYPERStackで液体ハンドリングとチェースチューブのクランプを閉じます。
3. フックベントフィルターチューブCSM上に保持するクランプに、負荷の位置でCSMにHYPERStack 36レイヤの容器を置きます。蓋を締めて、塗りつぶしの位置にCSMを移動する。正しい充填位置に容器を入れて、エアフィルターは、格納操作中に濡れを防ぐために、最も高い位置に今である。 10 °の角度許可equilibr充填時の層への液体について注意深く検討する必要があります。充填ウェッジで、その側に置かHYPERStack - 12層の容器は、充填のための正しい位置にあります。
4. HYPERStack容器（より高いではない）と同じレベルに袋を置いて充填ラインから澄んだ空気。チェースチューブクランプを保つことは閉じ、容器を入力して流体を許可する液体処理管クランプとメディアのバッグのクランプを開きます。
5. 袋のスタンドを使用して、容器内への細胞懸濁液の流れを支援するメディアのバッグを引き上げる。
6. 接種したメディアのすべてが血管に入るまで、容器を充填します。媒体の300mLのは、まだメディアの袋の上部に残るはずです。容器の充填継続するメディアの袋からクランプを外します。液体は、上側の空気のマニホールドに近づくと、充填にわたって防止するために、メディアの袋を下げて充填速度を遅くする。徐々に充填ラインへの液体レベルをもたらし、液体ハンドリングのチューブをクランプする。

7。層に液体をロックする分離方法

1. 多様体の両​​方のセットが最も高い位置になるように、分離位置にCSMのHYPERStackの容器を持参し、容器の高さの下にメディアの袋を下げてください。 HYPERStack - 12層の容器は、容器の側面に手を置き、充填くさびを持ち上げるために他を使用して分離位置に持ち上げることができます。
2. 直立した状態で開催されたチェイスのフィルタで、チェイスチューブクランプを開きます。これはメディアの袋に戻し、液体ハンドリングのチューブでメディアを空にするか、追うだろう。チューブが空になると、メディアのバッグのチューブのクランプを閉じてください。
3. 直立した状態で追いかけるチューブフィルタを保ち、残りの液体が容器に入ると平衡できるようにHYPERStackに液体ハンドリングのチューブにクランプを開きます。これが発生するために1-2分待ちます。
4. 多様体が左にあるように、CSMでHYPERStack容器を回して。 CSMの負荷の位置に容器を下げます。少し左にHYPEStack - 12層の血管をロッキングすること充填ウェッジの削除を許可します。チェイスと液体ハンドリングチューブの両方にクランプを閉じます。
5. メディアのバッグは、今や容器から除去することも、後で収穫の手順で使用するために取り付けられて残ることがあります。添付されたメディアの袋を格納するために、HYPERStack容器の収納トレイに保持バンドの下に空の袋と袋に残っているメディア、および場所をロールバックします。
6. インキュベーターにHYPERStack容器を移動する。血管の世話を運ぶときにエアベントフィルターに入るから液体なるように注意する必要があります。これは、わずかに上向きHYPERStackのマニホールドの端を傾けることによって達成される。

8。収穫プロトコル

1. 収穫の手順を開始するには、チューブは、収穫袋のアセンブリを形成するために一緒に細胞解離液とクエンチの袋を溶接。すべてのチューブのクランプが閉じていることを確認します。 （実証するために漫画を使用してください）
2. インキュベーターからHYPERStack容器を削除、保持バンドの下からのメディアの袋を解放し、袋のスタンドにハングアップする。負荷の位置でCSMに容器を置き、血管を保護するために蓋を締めます。保持クランプにベントチューブをフックし、フィルの位置にCSMを移動する。
3. メディアの袋チューブとメディアが添付された袋に流れるように容器の液体ハンドリングチューブのクランプを開き、袋のスタンドのメディア袋がHYPERStackより低くぶら下がっていることを確認して。
4. 一度船が約である¾空の、最後の空の位置にCSMの設定を変更してください。 HYPERStack容器と液体ハンドリングチューブが空のときに、費やされるメディアのバッグのチューブのクランプを過ぎてメディアを追跡するためにチューブを持ち上げ、その後液体ハンドリングチューブのクランプと過ごしたメディアバッグのチューブのクランプの両方を閉じます。
5. 管の溶接による収穫袋のアセンブリと過ごしたメディアの袋を交換して、袋のスタンドを使用してHYPERStackの高さは上記の細胞解離バッグのアセンブリの高さを上げる。
6. 平衡の位置にCSMを置きます。細胞解離液のチューブのクランプを開き、HYPERStackにソリューションを移す。転送が完了すると、液体ハンドリングチューブと細胞解離液をチューブにクランプを閉じます。
7. 負荷の位置にCSMをもたらす。水平方向の位置決めレバーが開いて保持することにより、穏やかに細胞層を介してソリューションを配布し、ホイールを使用して側に船の側を揺らし。容器は、時折ソリューションの平等な分配を維持するためにロッキングの間に平衡の位置に戻されることがあります。それは、層が完全にコーティングされていることを視覚的に明らかでないかもしれませんが、解離液は均等に細胞の表面に分散されます。解決策が十分に分散されると、負荷の位置でHYPERStackをロックするためにCSMのレバーを離します。この位置でHYPERStackを残すあなたの細胞に必要な解離時間の間。
8. 細胞がはがれるしたら、ガイドとして濁度を用いて、平衡の位置にCSMを移動する。ケアは、以上の細胞を消化しないように注意してください。クエンチ袋クランプとクエンチメディアが血管を入力できるようにするHYPERStackの液体ハンドリングのチューブクランプを開きます。転送が完了したらHYPERStackの液体ハンドリングのチューブのクランプを閉じます。
9. 負荷の位置にCSMを戻し、サイドに船の側の岩に水平方向の位置決めレバーを押し続けます。
10. 袋のスタンドを使用して、HYPERStackのレベル以下に収穫袋のアセンブリの位置を下げる。 、空の位置にCSMを調整して容器の液体ハンドリングのチューブのクランプを開き、バッククエンチ袋に細胞溶液を移す。負荷の位置にCSMを戻し、チューブシーラーを用いて容器から収穫袋のアセンブリを取り外してください。細胞溶液は、処理の準備ができています。

9。代表的な結果

• 標準ポリスチレンの表面からのガス透過性ポリスチレン表面への変換時に最適化される時間のニーズを収穫。細胞はHYPERStack製品でより速く解放する傾向がある。
• 顕微鏡下で細胞を表示するには通気口と液体ハンドリングのチューブは、オフクランプする必要があります。マニホールドは、顕微鏡のステージ上で、下向きのと、上下逆さまにHYPERStackの容器を置きます。
• 予防のステップは、それらが機能停止の原因となる使用中にフィルターを湿潤を避けるために撮影することができます。しないことでHYPERStack容器を充填し、通気口と追いかけチューブを保つ上から濡れが発生しないはず、クランプが開いているときに上昇。
• チューブ上の閉鎖クランプの圧力は、クランプが開かれた後、それが閉じたままになります。反対方向にチューブをつまんでは、それを開くでしょう。
• 重力のフィードを介してHYPERStackの容器を出入りするメディアフロー時間はHYPERStack容器内のメディアの最上位レベルの間にメディアの高さの違いとメディアのコンテナ内のメディアのトップレベルに基づいています。距離感が大きくなればなるほど、流れ速い。最大流量は1.5L/minのフィルタの定格によって制限されます。
• HYPERStack容器内の適切な充填量を維持することが細胞増殖のチャンバー内の空気気泡の形成を防ぐことができます。気泡は、サンプリングや蒸発水損失によるunhumidified環境でインキュベートすることにより発生することができます。追加の流体がエンドユーザによって追加する必要がある場合は、サンプリング量と周波数だけでなく、インキュベーションの条件が決定されます。

図1標準的な細胞培養容器内のメディアの酸素欠乏。図は3日以上の細胞のレベルでの酸素のmg / Lの減少を示しています。

図2標準的な細胞培養容器の培地中の酸素勾配。図は、酸素のmg / Lは細胞層よりもヘッドスペースの交差点へのメディアで最大であることを示しています。

図3。細胞増殖中HYPERStackの気管空間における酸素の割合。図は、96時間にわたって、それぞれのガス透過膜の底部を供給する層との間の酸素の割合は、、一定であることを示しています。これは、コンフルエントに成長中に酸素をアクセスするために細胞の能力を示しています。

Discussion

HYPERStack容器は、正常に成長し、プライマリおよび幹細胞を設計しています。容器内への流体の追加は、重力供給によって、また、無菌のメディアのコンテナからポンプによる無菌バッグの接続を介して行われている。容器は、同じ体積のフットプリントの積層板製品の対成長領域にある以上の2.5倍に増加しています。 HYPERStack - 12が6,000 cm ^2の成長分野を持っている、HYPERStack - 36は、18,000 cm ^2の成長分野を持っており、HYPERStack - 120は、成長地域の60,000 cm ^2としています。表面積を増やすことにより、ユーザは同一の細胞集団またはロットからの複数のセルを生産し、ばらつきを削減することができます。彼らはまた、同じセルの出力を達成するため、または人々、クリーンルームのスイート、またはインキュベータを追加することなく、セルの出力を高めるためにより少ない容器を使用して領域および/または労働を節約することができます。システムは、低微粒子アセンブリのメソッドを使用して、接着剤を使用せずに生成されます。それは、チューブセットとフィルターにあらかじめ組み込まれていますクローズドシステム、トリプル重包装と滅菌に提供されています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5L Bagged Media	Lonza Inc. (英語)	未定	1350ml培地+150ml美容液(必要な場合)
4.0L 袋入り培地	Lonza Inc.	未定	3600ml培地+400ml血清(必要な場合)
HYPERStack Vessel-12	Corning	10012
HYPERStack Vessel-36	Corning	10036
Filling Wedge	Corning	10040
Stack Manipulator	Corning	TBD
HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device	Hyclone	SH3B0324.01
600ml 袋入りメディアクエンチャー (10% FBS IMDM)	Lonza Inc.	TBD
600ml Cell Dissociation Solution	ロンザ	未定