ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ、開発の初期段階はよくイメージングアプローチに適している細胞の形状の変更の数によって特徴付けられる。この記事では、ショウジョウバエの胚のライブ共焦点イメージングに必要な基本的なツールと方法を説明します、そして細胞化と呼ばれる細胞の形状変化に焦点を当てます。
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この記事について
サマリー
要約
開発キイロショウジョウバエの胚では、共焦点イメージングを生きるために非常に従順な細胞形状の変化の回数を受ける。ハエの細胞の形状の変化は、高等生物と似ています、そして、彼らは組織の形態形成を駆動する。そう、多くの場合、彼らの研究は、ヒトの疾患（表1）1-5を理解するための直接的な意味を持っています。サブセルラー規模で、これらの細胞形状の変化は、遺伝子発現からシグナル伝達、細胞極性、細胞骨格の再構成と膜輸送に至るまでの活動の産物です。このように、 ショウジョウバエの胚は、彼らが組織の形態形成に関連する細胞の形状の変化を評価するだけでなく、文脈を提供するだけでなく、形状の細胞がそのサブ細胞の活動を研究するために完全に生理学的な環境を提供しています。
プロトコルは、画像細胞化と呼ばれる特定の細胞の形状変化をするように設計されてここで説明する。細胞化は、劇的な細胞膜の成長の過程であり、そしてそれは最終的に細胞性胞胚にシンシチウム胚を変換します。有糸分裂サイクル14の相間で、すなわち、原形質膜は、同時に一次上皮細胞のシートを生成するために〜6000皮質固定された核のそれぞれの周囲に陥入する。前の提案にカウンター、細胞化は、ミオシン- 2収縮6によって駆動されていませんが、代わりに主に内部貯蔵7から膜のエキソサイトーシスによって支えられています。従って、細胞化は、細胞質分裂や筋肉の横-細管（T管）形態形成などの原形質膜の陥入や拡張を必要とする細胞の形状の変化、中膜輸送を研究するための優れたシステムです。
このプロトコルは簡単にハエの胚で他の細胞の形状変化のイメージングに適用される、そして唯一のそのような胚のコレクションのステージを変更する、または特定の方向（表で胚をマウントする"胚の接着剤"を使用するなど、わずかな適応を必要としていることに注意してください1）8-19。すべてのケースでは、ワークフローは基本的には（図1）と同じです。クローニングおよびショウジョウバエ遺伝子導入のための標準的な方法は、緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその変異体に融合された、興味のあるタンパク質を発現するサシバエの在庫を準備するために使用され、これらのハエでは胚の再生可能エネルギー源を提供しています。また、蛍光蛋白質/プローブを直接簡単なマイクロインジェクション技術90から10を経由してハエの胚に導入されています。その後、発生事象および撮像される細胞の形状変化に応じて、胚を回収して解剖顕微鏡で形態によって上演され、最後に位置し、共焦点顕微鏡でタイムラプスイメージングのためにマウント。
プロトコル
1。胚のコレクションカップを組み立てる
- 可能な限りスムーズにエッジを作り、かみそりで100mLのトライコーンビーカーの底を切り取ります。これは絶対に必要ではないがカップは、この他、トップのオフ三つ角をトリミングした場合の処理が容易です。
- ワイヤーメッシュ（6センチメートル× 6 cm）の正方形をカット。予め温めておいたホットプレート上で、内部の換気フード、層頑丈なアルミ箔の部分の上にワイヤーメッシュの正方形の。ホットメッシュの上にしっかりとカップのカット下端を押してください。数秒待ってから、現在接続されているメッシュでカップを持ち上げる。箔も付く場合、単にオフに皮。
- 一晩コップを冷やす。細粒度のサンドペーパーを持つ任意の鋭いエッジをオフはさみ、そして砂で余分なメッシュを削除します。
2。アップルジュース寒天平板を作る
- 6Lフラスコに、100グラムBDバクト寒天と3L蒸留水を組み合わせる。遅い排気の設定で30分間寒天をオートクレーブ。
- 攪拌棒付き2Lフラスコに、100gのショ糖、1Lリンゴジュース、6 G P -ヒドロキシ安息香酸を組み合わせる。ホットプレート上で攪拌しながら沸騰するソリューションを加熱する。 2分以上沸騰しないでください。リンゴジュースの混合物が冷却し、寒天の撹拌棒を追加することができます。完全に混ぜる。
- 60x15ミリメートルペ....
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ディスカッション
ここに記述されているプロトコルは、開発途上ハエの胚の細胞の形状の変化の数のライブ、共焦点イメージングを可能にするでしょう。イメージングのためのGFPの株式は、個々の研究室（表2）により調製するが、多くのそのような株は、インディアナ大学（アットブルーミントンショウジョウバエストックセンターとしてのセンターからも公開されていることができるhttp://flystocks.bio.indiana.edu ）とハエトリソウエール大学（現在のストックセンターhttp://flytrap.med.yale.edu ）。一度取得したこれらのライブイメージングデータは、徹底的にそのドライブの細胞の形状変化と組織の形態形成蛋白質の機能は、サブ細胞の活動、および生物物理学的パラメータを定義するために定量分析と組み合わせることができます。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
我々は感謝して、このプロトコルが開発された基盤を提供するエリックヴィーシャウを、認めます。私たちの仕事は、ヴァーナ＆マーズマクリーン生化学部および分子生物学スタートアップ賞、ベイラー医科大学でサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| スライドグラス | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| カバーグラス 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| 洗浄ボトル (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| 50 ml Falconチューブ | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 小容量ピペット用バルブ, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| キャップ付きシンチレーションバイアル | VWR international | 66021-533 | |
| Tri-Cornビーカー, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | |
| BD Falconシャーレ 60x15mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| BD Falconセルストレーナー | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 黄色ピペットチップ | Rainin | L200 | |
| ステンレスメッシュ, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| ガラス製 5¾ インチ パスツールピペット | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| P4 ろ紙 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| 輪ゴム | Office Max | A620645 | |
| Scotch 両面テープ, ½ インチ | Office Max | A8137DM-2 | |
| Robert Simmons Expression 絵筆 E85 丸筆 #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | |
| Dumont #5 ピンセット 高精度 Inox | Electron Microscopy Sciences | 72701-DZ | |
| カミソリブレード | VWR international | 55411-050 | |
| ハロカーボンオイル 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| ヘプタン | Fisher Scientific | H360-1 | |
| BD Bacto Agar | VWR international | 90000-760 | |
| スクロース | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| p-ヒドロキシ安息香酸 | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Red Star アクティブドライイースト | LeSaffre | 15700 | |
| ペーパータオル, C-fold | Kleenex | ||
| 厚手アルミホイル | Reynolds Wrap | ||
| 漂白剤 | Austin’s A-1 Commercial | ||
| 100% アップルジュース | Ocean Spray または Tree Top |
参考文献
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
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