方法論記事

全マウントを使用するその場でハイブリダイゼーション

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DOI:

10.3791/2533

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2011年3月31日

 ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University, 2Department of Science Teaching, Syracuse University

この記事について

サマリー

全体のマウントその場でハイブリダイゼーション（WISH）は解剖を脊椎動物に加えて、上位学部比較脊椎動物の生物学のコースで使用されていました。これにより、学生は一つのコース内の分子とorganismal生物学の研究を結ぶだけでなく、肉眼解剖学などの遺伝子発現パターンを研究する機会を与えた。

要約

in situハイブリダイゼーション全体のマウント（WISH）は、全体のマウント標本内の特定のmRNA転写産物の局在によって遺伝子発現を研究するために使用される分子生物学の実験室における一般的な手法です。この技術は（アルバートとYelick、2005年から適応）シラキュース大学の上位学部比較脊椎動物の生物学の実験室の教室で使用されていました。比較脊椎動物の生物学実験講座の最初の3分の2は、学生が主に伝統的な解剖やモデルの使用を介して様々な脊索動物の分類群を表すいくつかの生物の発生学と肉眼解剖学を勉強する機会を与えた。コー​​スの最後の部分は、WISHがゼブラフィッシュ胚で実行された分子技術を採用する脊椎動物の発生の観察を通して解剖学を教えるために革新的なアプローチを含んだ。ヘテロ接合体線維芽細胞増殖因子8（fgf8a）変異体のライン、 エースは 、使用されていました。メンデル遺伝が原因で、エースは生産野生型、ヘテロ接合、そして午前1時02分01秒比率でホモ接合ace/fgf8a変異体をintercrosses。正中線のほか、心臓、体節、tailbud、筋節、脳などの解剖学的構造の開発に公知の発現パターンを持つRNAプローブを使用した。 WISHは、学生がクラス内の染色反応を行うと、13体節とプリム- 6の段階でゼブラフィッシュを用いて行った。開発のさまざまな段階でゼブラフィッシュ胚の研究は、学生がこれらの解剖学的構造は、個体発生を介してどのように変化したか観察する能力を与えた。さらに、いくつかace/fgf8a変異体は、不適切な心臓のルーピング、および体節と脳の発達の欠陥を表示。この研究室の学生は、外部の解剖学だけでなく、遺伝子発現パターンの両方を使用して、さまざまな器官系の正常な発達を観察した。彼らはまた、不適切な解剖学的な開発と遺伝子発現（すなわち、推定変異体）表示胚を特定し、説明した。

既に必要な機器を所有していない機関でまたはラボとカリキュラムの革新のための資金が限られているインストラクターの場合は、試薬と装置の金融コストは、時間と労力の一部に必要とされる、考慮する要因となる可能性があります設定に関係なくインストラクター。それにもかかわらず、私たちは教室の実験室の設定のこのタイプのWISHの使用は発生遺伝学と解剖学の間に重要なリンクを提供できると主張している。技術の進歩と分子レベルでorganismal開発を研究する能力がより簡単に、安く、そしてますます普及しつつあり、多くの進化生物学者、生態学者、そして生理学は分子生物学の分野での研究戦略に目を向けている。比較脊椎動物の生物学の実験室の教室でウィッシュ使用すると、分子と解剖学が単一のコース内に収束する方法の一例です。これは、上位レベルの大学生に、より多様な教育と今後の学際的な科学研究の振興につながる近代的な生物学的研究手法を、実践する機会を与えてくれます。

プロトコル

1。ターゲットcDNAのプラスミド形質転換

パートI：プラスミドの形質転換

（所要時間：3時間プラス一晩インキュベーション）

  1. 42℃の水浴中で暖かいSOC栄養ブロス（反応あたり500μL）
  2. 氷上でコンピテントセルを融解
  3. 25μLのコンピテントセルにプラスミド1μLを追加
  4. 20分間氷上に置き、
  5. 45秒間42℃の水浴中で熱ショック細胞
  6. すぐに2分間氷上で細胞を配置
  7. 細胞の各バイアルに42℃の栄養ブロスの500μLを追加
  8. ° C毎分255回転で2時間（回転数）で37振る
  9. ルリアベルターニ（LB）寒天プレート上にプレートを75μL変換ミックス
  10. 37℃で一晩反転プレートをインキュベートする

パートII：E.大腸菌の培養

（所要時間：15分プラス一晩インキュベーション）

  1. それぞれの反応、アリコート3 mlのLB培養液および培養チューブに50 mg / mLのアンピシリンの3μLのための
  2. 寒天プレートから1細菌のコロニーをかき取り、それぞれの培養チューブに加える
  3. 37℃で培養試験管を振る° Cを255 rpmで一晩

パートIII：プラスミドプレップ

（所要時間：1.5時間）

  1. 5内閣総理FastPlasmidミニキット（カタログ＃230万）を使用して一晩培養液からプラスミド分離する
  2. 調製したプラスミドの存在を確認するには、エチジウムブロマイドで染色1パーセントトリス - 酢酸- EDTA（TAE）ゲルでキットから溶出したDNAを実行する

（2） その場 DIG標識RNAプローブの合成で

パートI：プラスミドの直線化

（所要時間：2.5時間）

  1. 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。
    プラスミド準備 20 mLの
    制限酵素* 2 mLの
    バッファー** 10mLの
    10Xウシ血清アルブミン（BSA） 10mLの
    ジエチルピロカーボネート（DEPC）水 58 mLの
    100mLの
  2. 37℃で2時間インキュベート
    *プラスミドにより異なる
    **制限酵素により異なる

パートII：トランスクリプション

（所要時間：3時間）

  1. 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。
    線状プラスミド 4 mLの
    10X転写バッファー** 4 mLの
    ジゴキシゲニンでラベルのミックス 4 mLの
    ポリメラーゼ* 2 mLの
    RNase阻害剤 2 mLの
    DEPC水 24 mlの
    40mLの
  2. 1時間、37℃でインキュベートする
  3. ポリメラーゼ* 2μLを追加
  4. 1時間、37℃でインキュベートする
  5. DNaseの2μLを追加
  6. 37℃を20分間
    *プラスミドにより異なる
    **ポリメラーゼにより異なる

パートIII：降水量

（所要時間：一晩のインキュベーション、1時間に5分プラス2時間は、遠心分離と再サスペンドする）

  1. 0.2M EDTAの4μLを追加
  2. 4M塩化リチウムの5μLを追加
  3. 氷冷100％エタノールを150μLを追加
  4. 一晩は-80℃で2時間インキュベート
  5. 4℃、デカント離れて上清を、30分間、14,000 rpmで遠心
  6. 7分のドライペレット
  7. 20μLのDEPC水に再懸
  8. 37℃を5分間

パートIV：分画 - プローブのサイズが0.6 KBより大きい場合にのみ実行

（所要時間：通常は、プローブのサイズに基づいて20分以上を可変しない）

  1. 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。
    RNAプローブ 20 mLの
    DEPC水 12mlの
    重炭酸ナトリウム 4 mLの
    炭酸ナトリウム 4 mLの
    40mLの
  2. 60℃の水浴でインキュベートする。方程式でのインキュベーション時間をベース：
    時間（分）=（開始KB - キロバイトを希望する）/（KB X希望のKBを開始0.11 X）
    平均的な希望のサイズ= 0.6キロバイト

パートV：決勝降水量

（所要時間：5分一晩のインキュベーションにユートプラス2時間、遠心分離し、再一時停止する1時間、ゲル電気泳動のための1時間）

  1. 40μLDEPC水を加える
  2. 8μL酢酸ナトリウムを追加
  3. 1.04μL氷酢酸を追加
  4. 240μLの氷冷した100％エタノールを加えます
  5. 一晩は-80℃で2時間インキュベート
  6. 4℃、デカント離れて上清を、30分間、14,000 rpmで遠心
  7. 7分のドライペレット
  8. 20μLのDEPC水に再懸
  9. ミックスする渦
  10. リボプローブの存在を確認するには、エチジウムブロマイドで1％TAEゲル染色した上、再懸濁液を実行する

3。 in situハイブリダイゼーション全山

パートI：胚の固定およびプロテイナーゼK消化

（所要時間：修正晩プラス4時間のストレージのための次の日、2.5時間記憶からパートIIまで）

  1. ゼブラフィッシュ胚の段階収集し、4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド（PFA）で修正° C
  2. リン酸固定胚を洗うことは10分ごとのTween - 20（PBST）で3回0.1％を含む緩衝生理食塩水
  3. 先の細いピンセットを用いて実験的な試薬は、手動でdechorionate胚（必要に応じて）への胚の曝露を確保するため
  4. 一時間ごとに洗浄を25％の段階的な一連の洗浄及びPBSTで50％メタノールで胚を脱水し、-20℃で100％メタノールに保存する
  5. するときに使用する準備ができて、10分ごとに、PBSTで50％（2回）および25％（1時間）、メタノールで洗浄してPBSTで胚を再水和する。最終的に100％PBSTで10分間ずつ2回洗浄する。正確なタイミングは、PBST /メタノール洗浄のために重要ではありません。
  6. PBSTで10％の過酸化水素溶液中での漂白剤の胚は、必要に応じて、暗い色素を除去する。胚は、胚の年齢に応じて、10〜20分間過酸化水素溶液でインキュベートする必要があり、マイクロチューブのキャップは、空気の圧力の蓄積を防止するために開いたままにしてください
  7. 50 mg / mLのプロテイナーゼKでダイジェストの胚は、胚の年齢に応じて、3-15分間PBSTで1:5000に希釈
  8. その後、再修正の30分間、4％PFAで胚、および5分間ずつPBSTで3回洗浄

パートII：リボプローブのハイブリダイゼーション

（所要時間：3時間プラスハイブリダイゼーションのために一晩、1.5時間のパートIIIの翌日）

  1. 2〜3時間予熱した70℃の水浴中でプレハイブリダイゼーション溶液（PHS）で胚をプレハイブリダイゼーション
  2. 、PHSを取り除く70℃で一晩インキュベート0.5mLのハイブリダイゼーション溶液および1.5μL先に合成したジゴキシゲニン標識したリボプローブを、追加してください。温度は、リボプローブのターゲットに応じて数度以内に変動することができます
  3. 翌日、70で胚を洗浄℃で10分間ごとに、2X生理食塩水、クエン酸ナトリウム（SSC）におけるPHS 75％、50％、25％の段階的なソリューションで、その後68℃30分間0.2 × SSCで洗浄° C
  4. 室温で10分間ずつのマレイン酸バッファー（MAB）2回で洗浄する

パートIII：抗ジゴキシゲニン（α- DIG）抗体のインキュベーション

（所要時間：3時間プラス第IV部に次の日、2.5時間をブロックするために一晩）

  1. 12ウェルプレートに胚を移す
  2. 室温で少なくとも3時間は1-2 mlのブロッキング溶液中でプレブロックの胚
  3. 同時に、このソリューションでブロッキング溶液の2番目のボリュームを準備し、抗ジゴキシゲニン抗体1:2000希釈して抗体を事前に遮断する
  4. 事前にブロックを取り外し、事前にブロックされたα- DIGソリューション1〜2 mLを加え、4℃で一晩インキュベート
  5. 翌日、MABで胚を洗浄する。胚は最初の5分間MABでインキュベートすることを許可し、バッファの変更を行うと、2つの10分、1 30分一​​60分間隔でインキュベートする。正確なタイミングは必要ありません
  6. アルカリホスファターゼ（AP）バッファ内の胚の各5分間3回洗浄

パートIV：染色と最終処理

（所要時間：1時間染色のための晩​​には、使用するリボプローブに応じて、グリセリンソープ、グリセリン洗浄あたり6〜10時間、の先頭に4時間はグリセロールに保存されていることがあります）

  1. 染色が十分になるまで、胚に1 - 2mLの染色液を追加箔でプレートをラップし、定期的な間隔（20分毎程度）で染色をチェック
  2. 染色反応を停止するために各5分間PBSTで2回胚を洗う
  3. バックグラウンド染色を削除するには、その後100％メタノールで、PBSTで25％（1時間）と50％（2回）メタノールで10分間洗浄を使用して、胚を脱水する
  4. 胚は、室温で少なくとも2時間、100％メタノールでインキュベートすることができます
  5. 50％で10分間洗浄（2回）および25％（1時間）PBSTでメタノールを使用して、PBSTで再水和する、その後100％PBST 2回洗浄
  6. ステンドメールを転送する4で段階的な一連の洗浄、およびストアを使用してPBSTで80％グリセロール溶液にmbryos、℃の

レシピ：

  • LB寒天プレート - 10 gのLB寒天+ 250mLの蒸留水、オートクレーブは、ときにタッチにクール各シャーレに15-20 mLの温溶液を注ぎ、250μLアンピシリンを追加、寒天が固化することができます
  • LBブロス- 12.5 gのLB培地+ 200mLの蒸留水、オートクレーブは、使用前に冷却することができます
  • 1％TAEゲル- 0.4 Gアガロース、40 mLの1X TAE、2μLのエチジウムブロマイド、負荷7μLプラスミドを（プラスミドcDNAターゲットの変換）または3μLリボプローブと4μLDEPC水（ その場 DIG標識RNAプローブの合成語 ）+ 1μLローディング色素、5μLのDNAラダー
  • プレハイブリダイゼーション溶液、50％ホルムアミド、5X SSC、9.2mMクエン酸、1％のTween - 20
  • ハイブリダイゼーション溶液プレハイブリダイゼーション溶液に加えて500μg/ mlとtRNAと50μg/ mlのヘパリン
  • MAB - 100mMのマレイン酸、150mmの塩化ナトリウム、7.5〜0.2MのNaOH、0.1％のTween - 20、pHは
  • MABでのブロッキング溶液、3部MAB、1部10パーセントベーリンガーブロッキング試薬、1部の熱は、子羊血清を非アクティブに
  • 9.5〜APバッファ- 60mmのトリス- HCl pHは、60mmの塩化ナトリウム、30mMのMgCl 2を 、0.1％のTween - 20
  • 染色液- 5 - ブロモ-4 - クロロ-3 - インドリルリン酸（BCIP）とのニトロブルーテトラゾリウム（NBT）APのバッファ

4。駐在結果

正しく実行する場合は、NBT、BCIP、およびアルカリホスファターゼとの反応では、紫色の染色としてゼブラフィッシュ胚に表示される紫色の沈殿物を形成します。リボプローブは、以前は次の目的の遺伝子に対応するcDNAから合成する必要があります。したがって、それはあらゆる汚れを可視化が目的の遺伝子がその特定の発生段階で転写されているゼブラフィッシュの領域を表すと結論することができます。 fgf8a（Reifersら 、1998; 図2）。deltaC（オーツら、2005。）当コースの目的のために、リボプローブはaldh1a2（; Begemann ら、2001;図1以前raldh2）から合成された。 myod1（ワインバーグら、1996）; shha（。クラウスら、1993）、pax2a（ブランドら 、1996; 図 3）とmyl7（以前cmlc2;。Yelonら 、1999）cDNAを。染色は、正中線にし、体節、tailbud、筋節、脳、および心臓を含む解剖学的構造に期待されていた。Ace/fgf8a変異体は、これらの構造の多くの欠陥を持っていると予想された。染色が容易に標準的な解剖顕微鏡を用いて可視化した。 （Schoenwolf、2009。D'コスタリカら 、2009; Schmoldt ら 、2009年。クラーク、2003）その他の情報源はここに記載されたものと同様の手法をウィッシュについての詳細およびトラブルシューティングが含まれています。

図1
aldh1a2のための特定のリボプローブとハイブリダイズされている図1。ゼブラフィッシュ胚24時間後に受精、。特定の染色は、目、後脳、胸びれ芽原基、および体節で見ることができます。前方の上部にある、後は一番下にあります。

図2
図2。fgf8a用プローブの特異的にハイブリダイズされた開発の13体節期ではゼブラフィッシュ胚。特定の染色は、終脳、間脳背側、中脳後脳境界、体節、およびtailbudで見られます。腹側が左側に、背側は右側にあります。

図3
図3。pax2a、神経系を可視化するための有用な堅牢なマーカーのためのリボプローブの特異的にハイブリダイズされた22時間後に受精のゼブラフィッシュ胚。特定の染色は、脈絡膜裂、中脳後脳境界、耳胞、および脊髄の神経細胞で見ることができます。左前方と背側ビュー。

ディスカッション

WISHは、学生が既知の遺伝子発現パターンの可視化によって解剖学的発達における遺伝学の役割を理解するための比較脊椎動物生物学の実験室のコースで使用されていました。コー​​スの前半では、学生はそれらの十分な時間が、勉強の理解、比較、およびコントラストの脊椎動物の解剖できるように、いくつかの異なる脊索動物の分類群を代表する生物に解剖を行った。

もちろん第二部への導入として、生徒たちはゼブラフィッシュの開発と解剖学を記述する正式な講義を与えられた。 WISHの実験の方法と期待される結果についても議論された。学生はその後、体節形成と発展のプリム- 6ステージでのライブゼブラフィッシュを与えられた、そして2および5日後に受精（DPF）で解剖顕微鏡下で調べることができます。これは、学生がゼブラフィッシュの胚はどのようなものをより深く理解し、個体発生を介して起こる形態学的変化の種類を提供することでした。

次のラボセッションでは、生徒が以前に実行された希望するゼブラフィッシュ胚を与えられた。彼らは、関心の各遺伝子（リボプローブ使用）のために遺伝子の発現パターンを研究し、記述するように求めていた。 WISHのために使用される胚は、ヘテロ接合ace/fgf8aラインのメンバーの間で交配から得られた。メンデル遺伝に基づいて、ace/fgf8aの交配からの胚の25％はホモ接合変異体であることが、このコースに焦点を当てた解剖学的構造の多くの欠陥を示すことが期待されていた。アルバートソンの研究室で発表された報告と未発表の観察に基づいて、脳や不適切な心臓のルーピングに欠陥が期待されただけでなく、体節の欠損（ブランドら、1996;。アルバートソンとYelick、2005;個人的な観察 ​​）。

学生は提示、各遺伝子の発現パターンのために、すべての標本、野生型（ヘテロ接合の動物は、開発の早い段階で野生型の兄弟から区別できない）とホモ接合変異体を調べるように求めていた。彼らはその後、欠陥のある遺伝子の発現は、解剖学的奇形が沈殿している可能性がありますか、それらの結果を記述する実験レポートを書くように頼まれ、解剖学や遺伝学の知識に基づいていた。

学生は、興奮と好奇心でこの実験室での練習を受け取るように見えた。最も前にウィッシュ使用がなかったと極めて当然のこの部分に興味を持っていた。学生が興味をそそるゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現の異なるパターンを見つけ、いくつかにも説明した染色パターンは、スマイリーフェイスのようなよく知られているデザインや記号、それらを関連付けることによって可視化。その結果、ラボのレポートは、学生がWISHのプロトコルと、特定の解剖学的構造における遺伝子の発現の一般的な理解を持っていた示した。 。。Huelskenら、2002;。Geetha - Loganathan ら 、2008A、Geetha - Loganathan ら 、2008bの研究室（スティックニーら 、2000年にウィッシュを用いて調べた生徒も遺伝子の特定の機能を理解する必要がありました。 ）。それは、特定の学生が限られたバックグラウンドのシグナル伝達経路の知識と関心のある遺伝子を持っていたこと、しかし、明らかになった。これらの概念の詳細については、導入の講義は、将来の比較脊椎動物の生物学のコースでWISHの使用に歓迎さかもしれない願っています。

プロトコルは一般的にコースのスケジュールに応じて、4日連続がかかるので、学生はクラスとインストラクターが、残りの責任でなければならないの実験の一部を完了することができます。ティーチングアシスタントがすべての前の手順を実行しながら、比較脊椎動物生物学のクラスで、学生は、実験室で染色反応を完了した。それは実行がクラスで希望する学生の方を好まれる方が多い場合、プロトコルは、クラスの時間枠に応じて、いくつかの実験室でのセッションにまたがって実行可能なサブユニットに分割することができる。それが一度だけここで週にラボの会議のためだったので学生は、全体のプロトコルを実行するために実行可能でない場合、学生はクラスの先頭に染色液を追加し、使用するリボプローブに応じて、完全な染色を持つことができます時間内に。それは開発する染色に要する時間は、それぞれのリボプローブとの様々な実験条件によって大きく変化し、クラスの前にあらかじめ決定されるべきである。特に、学生が唯一の研究室で染色を開発する場合、インストラクターは、教室の外でかなりの時間と労力を必要とするすべてのこれまでの手順、責任を負います。必要に応じて、ウィッシュより短い代わりに、タンパク質の局在を可視化する抗体のラベルを使用して、免疫組織化学かもしれない、しかしこの時点で、発達遺伝子のゼブラフィッシュ特異的抗体は、容易に入手可能ではありません。別のオプションは、別の脊椎動物種でWISHを実行する方法です。NDは、学生がさまざまな生物で、同じ遺伝子の発現パターンを比較しています（。。荒巻ら、2007;。新興のモデル生物、2008; Pizard ら 、2004新興のモデル生物、2010）。

比較脊椎動物の生物学コースでWISHを使用しての包括的な目標は、分子生物学的手法、解剖学的発達を研究するために使用される方法を学生に示すことでした。また、遺伝子発現だけでなく発達奇形にも進化的変化につながる可能性がありますどのように変更されたのと推測することは学生のための機会を提供した。進化発生生物学（しばしば"EVO -ディーヴォ"とも呼ばれる）として形式化、研究のこの急速に成長しているフィールドは、開発を通じて遺伝子型と表現型をリンクするために、そして進化的変化の潜在的な機械論的基盤の解明を目指します。このフィールドの上昇に伴い、より多くの生態学者、organismal生物学者、そして生理学者は彼らの研究に分子技術を採用しています。我々は比較脊椎動物生物学コースでWISHの使用が研究中の現在の技術や概念の進歩でこれまでに、生物学的サブフィールドを組み合わせることにより、上位レベルの生物学コースのよりよい水平方向の配置を容易にするためのカリキュラムを維持するために役立つと主張している。また、この統合的なアプローチは、より多様な教育と今後の学際的な科学研究の振興につながる、学生は一つのコースで、生物学的研究手法の品揃えを学ぶ機会を提供します。

開示事項

利害の衝突は宣言されません。

謝辞

著者は、比較脊椎動物の生物学コースの管理における役割についてはシラキュース大学と博士マリリンカーで生物学科に感謝したい。アルバートソンの研究室は、歯科および顎顔面研究所の健康/国立研究所の国立研究所からの助成金R21DE019223だけでなく、老化健康/国立研究所の国立研究所からの助成金R01AG031922によってサポートされています。

材料

  • オートクレーブ
  • マイクロ遠心機
  • 37℃のインキュベーター（シェーカー付）
  • 4℃のマイクロ遠心
  • ウォーターバス
  • 渦
  • ゲル電気泳動装置
  • -20℃の冷凍庫
  • -80℃の冷凍庫
  • ロッカー/シェーカー
  • 4℃の冷蔵庫
  • 解剖顕微鏡（できれば授業の画面やカメラ付）

参考文献

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