開発時にどのようにニッチと幹細胞の形態は、実用的な意味を持つ重要な問題です。のショウジョウバエ卵巣、生殖系列幹細胞とその細胞のニッチは、幼虫の発育中に形成する。このビデオでは、後期三齢（LL3）から女性の生殖腺を、解剖染色およびマウントする方法を示していますショウジョウバエ幼虫。
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この記事について
サマリー
要約
多くの臓器は、胚発生時と成人期の間にメンテナンスや修理のための彼らの開発のための幹細胞に依存する。どのように幹細胞形態、およびそれらがどのようにその環境と相互作用を理解することは、開発、ホメオスタシスと疾患を理解するため、非常に重要です。 ショウジョウバエの卵巣は、彼らの体細胞の支持細胞（ニッチ）1、2の生殖系列幹細胞（GSCs）の相互作用のための有力なモデルを務めている。遺伝的にそれらを操作する能力に結合ニッチの既知の場所とGSCsは、研究者は幹細胞とそのニッチ3月12日の間の相互作用の様々な解明することができました。
GSCメンテナンスと分化の制御機構に関する豊富な情報にもかかわらず、比較的少ないがGSCsとその体細胞のニッチは、開発中に形成する方法については知られている。その細胞成分の端末フィラメントとキャップの細胞（図1）、第三幼虫齢13から17の間にフォームを含む約18体細胞ニッチ、。 GSCsは、始原生殖細胞（始原生殖細胞）に由来する。 PGCは初期の幼虫の段階で増殖するが、ニッチの形成に続いて始原生殖細胞のサブグループはGSCs 7、16、18、19になります。一緒に、体細胞のニッチ細胞とGSCsは、生物の生涯を通じて卵を生成する機能的なユニットを作る。
GSCユニットの形成に関する多くの質問が未回答のままである。このようなニッチと幹細胞の前駆体の前駆細胞間の調整、またはそれらがGSCsになると始原生殖細胞内の非対称性の生成などのプロセスは、最善の幼虫で検討することができます。しかし、幼虫の卵巣の開発の方法論の研究は、物理的に困難です。最初に、幼虫の卵巣は小さくなります。であっても後期幼生の段階で彼らは、全体で唯一の100μmのです。さらに、卵巣は透明で、白い脂肪体に埋め込まれています。ここでは、蛍光抗体で染色することによってこの後に続く三齢（LL3） ショウジョウバエの幼虫、から卵巣を分離するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。我々はそのような、卵巣の位置をシンクしていない組織を染色し、洗浄し、抗体が組織に浸透することを確認してなどの問題に対していくつかの技術的ソリューションを提供しています。このプロトコルは、以前の幼虫の段階にとだけでなく、幼虫の精巣に適用することができます。
プロトコル
1。産卵
- 解剖前の5日間：交尾雌は酵母を添加した新鮮な食品に2〜4時間の卵を産むことができる。同期化されるにとよく発達した幼虫、それは（約30卵/ 25ミリメートルバイアル）培養を混雑していることが重要です。通常は、7月16日女性は彼らが横たわってどれだけに応じて、バイアルごとに使用されています。
2。幼虫の選択
- リンゲル培地（128mMのNaCl、2mMのKCL、1.8mmのCaCl 2で 、4mmのMgCl 2を 、35.5mMスクロース、5mMのHepes緩衝液pH 6.9）で満たされた9もガラス解剖皿を準備します。
- リンガーの培地を含む6ウェルプレートに細胞ストレーナーを準備し、氷の上に置きます。また、我々はナイロンメッシュを装着した特別に作られた金型を使用してください。
- 微細な生物学的なピンセット（鉗子）を使用してバイアル壁から時限幼虫を選択し、リンゲルを含む解剖皿に置いてください。
- きれいよくする女性の幼虫を移す。我々は、彼らの生殖腺で、男性から女性を区別する。雄の精巣は、簡単に脂肪体の後部3分の1に埋め込まれた大きな明確な楕円形のように識別されます。脂肪体の同じ部分に位置する女性の卵巣は、、はるかに小さい、透明な、丸い球体として識別することができます。
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ディスカッション
このビデオでは、後期三齢幼虫卵巣の単離と染色プロトコルを示しています。日常的にかつ確実にこのプロトコルを実行するには、注意が以下の点に注意を払う必要があります。
- 同期とよく発達した幼虫の場合は、上の混雑を避ける必要があります。
- 小さな半透明の卵巣の損失を避けるために、脂肪体はそのまま分析することを確認してください。また、これは（第2または第3齢幼虫の始まり）若い卵巣を取り付ける場合は特に、取り付けの段階で卵巣を見つけるのに役立ちます。
- 一度に多くのサンプルを処理するためには、セルストレーナーや他の仕掛けを使用してください。
- 試料が乾燥しないようにします。
- 我々は、載置台に良い立体顕微鏡を使用してください。片側暗いと透過光のベースを使用すると、半透明の卵巣と白色脂肪体との間のコントラストが卵巣を見つけて、操作を容易にどこに我々は条件を見つけることができる提出した。
- 取り付けに続いて、繰り返し温度変化を避けるため、これは抗体の解離を引き起こし、染色の品質を軽減。
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
IMは、マリーキュリーの再統合の助成金によってサポートされています。この作品は、イスラエルの科学基金グラントのないによってサポートされていました。 1146年から1108年、ヘレンと幹細胞科学のワイツマン研究所での研究とLeir慈善基金のためのマーティンキメル研究所による。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| NaCl | JT Baker | ||
| 塩化カリウム | Merck & Co., Inc. | ||
| 塩化カルシウム2 | Sigma-Aldrich | ||
| 塩化マグネシウム2 | Merck &株式会社 | ||
| スクロース | JT Baker | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| リン酸緩衝生理食塩水 | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| ウシ血清アルブミン 分画V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont生物学用ピンセット 5 dumstar ポリッシュ仕上げ | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| ニッケルメッキピンホルダー | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s ミニチュアピン 直径0.1mm、長さ10mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9ウェルプレート 85X100 mm、外径22mm x 深さ7mm | Corning | 7220-85 | |
| 標準透過光ベース TL ST 搭載 実体顕微鏡 MZ 16.5 | Leica Microsystems | ||
| 6ウェルプレート | Costar | 3516 | |
| スライド | メンゼル・グレイザー | 798 | |
| カバーガラス | Corning | 2940-223 | |
| 封入剤 | Vectashield | H-1200 | |
| セルストレーナー | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| 交通渋滞の解消 | ドロテア・ゴット博士研究室 | ||
| 抗Vasa抗体 | Ruth Lehmann博士の研究室 | ||
| 抗 β$\beta$-ガラクトシダーゼ | カッペル | ||
| 二次抗体 | Jackson ImmunoResearch |
参考文献
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21<....
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