生殖可能性を評価するためのクローン原性アッセイの適用は50年以上のために設立されました。ここでは、接着細胞とクローン原性アッセイを行うための一般的な手順を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
クローン原性（またはコロニー形成）アッセイは、50年以上のために設立されました。テクニックを記述したオリジナルの論文は1956年1に掲載されました。離れて方法を文書化するから、最初の画期的な研究は、培養1のX線照射した哺乳類（HeLa細胞）細胞の最初の放射線線量応答曲線を生成する。 control未処理の細胞とそのような暴露などの様々な治療を受けた細胞の間で、基本的に、クローン原性アッセイは、生殖生存率の違い（50以上の細胞のコロニーを形成する単一のセル、すなわち子孫を生成する細胞の能力）のアセスメントが可能に電離放射線、様々な化学化合物（例えば、細胞毒性薬）や他の場合における遺伝子操作へ。アッセイは、放射線生物学で最も広く受け入れられている技術となっていると広く異なる細胞株の放射線感受性を評価するために使用されています。さらに、クローン原性アッセイは、一般的に化合物を変更する放射線の有効性を監視するために、異なる細胞株のコロニー形成能力、に細胞毒性薬と他の抗がん治療薬の効果を決定するために使用されます。接着細胞株を使用する典型的なクローン原性生存実験ではコロニーを固定し、染色つの異なるコンポーネントが、1）組織培養フラスコで細胞単層の治療、2）単一の細胞懸濁液の調製とペトリ皿と3に適切な数の細胞をプレーティング）を含む関連する潜伏期間の後、これは細胞株によっては、1〜3週間から範囲にすることができます。ここでは、不死化したヒトケラチノサイト細胞株（FEP - 1811）2の使用で接着性細胞株をクローン原性アッセイを行うための一般的な手順を示しています。また、私たちの目的は、放射線に対する細胞の曝露後のコロニー形成率と生存率の分数の計算を含むクローン原性アッセイの共通の特徴を記述するために、そして天然の抗酸化製剤の使用と放射線応答の変更を例示することがあります。
プロトコル
1。細胞培養と実験セットアップ
- ヒトケラチノサイトは、L -グルタミン（2mM）を、上皮成長因子（5 ngのを補充したケラチノサイト- SFM（K - SFM）培地（GIBCO、無血清培地）15mLを含む75センチメートル2組織培養フラスコの単層として維持されています/ mL）を、ウシ下垂体抽出物（40μg/ mL）を、20 mg / mLのゲンタマイシン。細胞は37℃で加湿5％CO 2環境下で栽培されています
- 細胞は、K - SFM培地5 mLを含む12 × 25cm 2の組織培養フラスコに播種されています。
単一の細胞懸濁液をトリプシン処理によって調製される。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、5〜10分間0.05％トリプシン/ EDTA溶液と共にインキュベートされています。細胞は丸くし、約30％が切り離されているになるために起動すると、10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地の3倍量のトリプシンを中和するために追加されます。細胞は（20回）ピペッティングによって切り離されている。細胞を、血球計を使用してカウントされます。
適切な細胞数は細胞株の倍加時間（人間FEP - 1811ケラチノサイトで約20時間）に応じて播種されています。目的は、実験の日に〜90％コンフルエントに（フラスコあたり〜10....
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ディスカッション
この例では、人間のFEP - 1811ケラチノサイトは、最大100μg/ mLのCPFへの種々の濃度で処理した、データは37℃で1時間に20μg/ mLのCPF℃であるために示されています治療後の細胞は、137 Csのソース（; Nordionインターナショナル、カナダ、ON、1.6 Gyの/分Gammacell 1000年エリート照射器）を使用して、4 Gyで照射した。制御のために未処理と薬剤のみの治療法100個の細胞は、それぞれのペトリ皿に播種したとディッシュあたり1000個の細胞は、照射試料のためにプレートした。上記の表に示すように、コロニーを実体顕微鏡またはデジタル画像（図1）を用いてカウントしたImageJを用いて計数のために採取した。 five皿の平均コロニー数は、コロニー形成率と生存率を計算するために使用されていました。データは、天然の抗酸化製剤で放射線防護効果（保護因子〜3）を示した。
代表的な結果
| 治療 | ....... |
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 HRは、オーストラリアの大学院とBakerIDI明るい火花の賞でサポートされています。この作品は、オーストラリア政府の共同研究センタープログラムの下で設立された、サポートされている医学開発株式会社（CRC - BID）、のためのCRCによって運営されている。 COは、オーストラリアの大学院賞とCRC - BIDの補足奨学金受取人です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| ケラチノサイト用無血清培地 | 増殖培地 | Invitrogen | 17005042 | 2mM L-グルタミンを添加し、20μg/ml ジェンタマイシン、上皮成長因子、ウシ下垂体抽出物 |
| トリプシン-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 接着細胞を剥離させるための0.05%トリプシン/EDTA；Ca不含PBSで希釈した10倍ストック溶液2+/Mg2+. | |
| ダルベッコ’修飾必須培地 | 増殖培地 | Invitrogen | 11885-084 | 10% FBSおよび20を添加したμg/ml ジェンタマイシン；トリプシン/EDTAの中和に使用。 |
| 0.09%生理食塩水 | 溶液 | コロニーの洗浄に使用する。 | ||
| 10% 中性緩衝ホルマリン溶液 | 溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | 約4% ホルムアルデヒド：コロニーの固定に使用。 |
| クリスタルバイオレット | 粉末 | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01%クリスタルバイオレット溶液（蒸留水にて調製）2コロニーの染色に使用されるO。 |
| Gammacell 1000 elite 放射線照射装置 | Nordion International Inc. | |||
| シャーレ | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| 血球計数器 | Hawksley；医療・実験機器 | AC1000 | ||
| クローニングボックス | 蓋の反対側に穴が開いたプラスチック製のボックス。コロニー形成のための長期培養中にペトリ皿を保管するために使用する。 | |||
| 実体顕微鏡 | タイプ102 | ニコン製機器 | ～からなるコロニーの計数に使用される >50個の細胞 |
参考文献
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88,....
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