心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

サマリー

多数の遺伝子操作及び/または遺伝子、タンパク質、細胞、および/または生体物質の心筋内注射は、急性虚血/再灌流傷害およびマウスにおける慢性的リモデリングの研究に時間の次元に重ね合わされている。このビデオでは、虚血/再灌流、恒久的な冠動脈結紮、および心筋内注入の研究のための顕微手順を示しています。

要約

マウスモデルは、心筋の急性損傷および慢性的なリモデリングをin vivoで研究するための貴重なツールです。個体全体または心筋への遺伝子改変や、さまざまな生物学的および／または合成材料の登場により、これらを組み合わせることで、急性虚血性損傷の程度を軽減し、心筋リモデリングに伴う心不全の発症を抑制できる大きな可能性があります。

ここでは、この微小外科手術を確実に行うための方法と材料、および一時的（再灌流あり）または永続的な冠動脈閉塞研究や心筋内注射に用いる修正方法について提示します。術中に観察される心臓への影響、および実験終了時の評価に加えて、組織学的評価を行うことで有効性を検証します。

簡潔に述べると、外科的手順の準備には、マウスの麻酔、胸部の除毛、および手術部位の消毒が含まれます。気管内挿管は、光ファイバーライトを用いた経食道照明によって行います。その後、チューブを人工呼吸器に接続します。胸部を切開し、大胸筋を露出させて切開し、肋骨を確認します。虚血/再灌流研究では、心臓上に配置した1 cmのPEチューブに結紮線を結びつけ、閉塞/再灌流を個別に調整できるようにします。心筋内注入には、滅菌済みの30ゲージ面取り針を備えたハミルトンシリンジを使用します。心筋操作が完了した後、肋骨、大胸筋、皮膚の順に縫合します。ラインブロック麻酔は、皮膚を閉じる前に筋肉層に塗布する、滅菌生理食塩水で希釈した0.25%マルカインによって行います。マウスに生理食塩水を皮下注射し、腹臥位で安定するまで保温チャンバーに入れます。その後、動物飼育室に戻し、組織採取まで標準的な条件下で飼育します。屠殺時にマウスを麻酔し、KClまたはBDMを用いて心臓を拡張期に停止させ、生理食塩水で洗浄した後、固定液に浸漬します。続いて、処理、包埋、切片作成、および組織学的染色の一連のルーチン手順を実施します。

マウスの非外科的挿管および記述されている微小外科的操作は、習得し再現性を得ることが技術的に困難なモデルです。これらの手順は、時間的な閉塞や再灌流、または心筋内注射のための結紮操作を一定に行うことの難しさと相まって、生存率に影響を及ぼす可能性があるため、最適化と一貫性が極めて重要です。

プロトコル

1. 滅菌手術器具（表1）及び3"綿ひっくり返されたアプリケーターは、滅菌underpad上に配置されています。ビーズ滅菌器（Germinator 500）オンになっている。
2. マウスは（年齢：> 6週間、重量：> 18グラム）は、トリブロムエタノールの20μlの/ gのBW（; - 約40分持続250mg/kg）の腹腔内注射で麻酔する。
3. マウスはつま先-ピンチに応答しないときは、乾燥や胸部の左側からそれらを保護するために目に適用される滅菌潤滑油が（涙がリニューアル）皮膚から毛を削除するには、脱毛剤（例えばNairさん）でコーティングされています。
4. 脱毛は、実行中の暖かい水とbetadine /アルコールスワブで洗い流される外科領域の消毒に使用されます。
5. マウスは、プレキシガラスのテーブルに固定されている暖かいdeltaphase等温パッドの上に配置されます。各肢は、テープを使用して固定化されていると太い糸ではその場で上顎を保持するために上部の歯の下に水平に配置されます。
6. テーブルは、垂直に配置されており、光ファイバ、光は経食道照明のために頸部に直接輝いています。これは、このようにPEチューブの挿入を​​容易に可視化するために気管を可能にする、喉の開口部が明るいオリフィスとして表示されるように正確に配置する必要があります。
7. 速度125回/分;最大吸気圧10月12日CMH ₂ O; *注チューブは、一定の陽圧換気（TOPO人工呼吸器を管理するための人工呼吸器（95％O ₂ / 5％CO ₂に接続）に接続されています：設定値）は、ひずみとジェンダー1-3異なります。換気が同期胸の動きが確認されると、接続が手術中に抜管を防ぐためにテープでパッドに固定されています。
8. 胸から持ち上げ、皮膚を引っ張って歯鉗子を使用すると、第3位メスハンドルに接続された第10滅菌外科用メスの刃は、胸骨に皮膚と平行に1.5センチメートル切開を行うために使用されます。
9. 湾曲したヴァンナのmicroscissorsは胸筋をカットし、肋間筋に小さな穴を作るために使用されます。
10. ストレート、鈍microscissorsは3リブカットスルーするために使用されます。
11. 9ミリメートル小児眼科の反射鏡は、胸郭を撤回するために使用されます。
12. 湾曲鉗子を使用して、心臓からの心膜を引っ張り、ゆっくりとそれが開いて破れに歯鉗子を使用してください。
13. Castroviejo針ホルダーは6mmテーパーポイント3月8日針の糸を使用して、冠動脈を（心の長軸に沿って）左前下に8から0ポリエチレン縫合糸は、それに垂直。
    1. 時限再灌流のために削除できる一時的な合字の場合は、PE90の滅菌0.5〜1センチメートルピースが冠状動脈と平行に中心に配置されます。第一冠状動脈の下にループされた縫合糸が、、その後、チューブに接続されています。それが解放される時に、合字を緩めている。希望と閉塞/再閉塞の時は^4を変更できるようにこれを繰り返すことができます。プロトコルの長さと使用される麻酔の種類に応じて、補充が必要になることがあります。
    2. 永続的な閉塞の場合は、冠状動脈の下混入合字は、単に接続されています。白化やジスキネジアは明らかであり、縫合糸の長い方の端^を 5〜10カットされます。
    3. 心筋内注入（S）の場合は、30ゲージ滅菌斜め針付き滅菌ハミルトンシリンジは、合字の右側の損傷の領​​域の上に心の底に導入される。針は、傷害の領域に進出し、わずかにベベルが約国境地帯で見られることが引き出される。シリンジ内の溶液（2 -3μl）の一部は心臓に注入し、針を所定位置に保持される。注射器は、別の1〜3ミリメートル撤回され、ソリューションの残りの部分は注入されます。ソリューションによって形成される水疱が消散するまでシリンジを所定位置に保持される。針はその後削除されます。いずれかの出血がある場合は出血^5-7停止するまで、綿棒を静かに針の挿入部位に押し付けている。
14. 心筋の操作が完了すると、リブのリトラクターが削除され、胸腔は6から0 surgiproの縫合糸を使用して2〜3マットレス縫合で閉じられます。
15. 2〜3マットレス縫合糸は、筋肉に適用され、その後2〜3マットレス縫合をするために行われる、滅菌生理食塩水0.25％marcaine 1:10（0.1ml/25gマウス）の1-3滴を胸の筋肉を閉じるために作られています皮膚を閉じます。
16. マウスは、人工呼吸器から削除されます。一度リズム、急速な、浅い呼吸が確認され、マウスを抜管することができます。
17. 0.5ミリリットル暖かい滅菌生理食塩水は、背側皮下空間に注入され、それがモビリティ（1時間の最小値を）取り戻すまでのマウスは、ケージ内の温暖化のパッドの上に配置されます。
18. 生存実験のために、マウスをケージに戻し入れられ、屠殺時までビバリウムに戻った。最初の2日間、食べ物は湿らせた摂食を促進するためにケージの床の上に配置（ので、彼らは痛みを引き起こす可能性があるまで到達する必要がない）とブプレノルフィンは6 - 12時間毎に投与する必要があります。術後のケアも十分な可動性、身づくろい、そして食習慣を確認するために最初の週の毎日の監視が含まれます。
19. 手術器具はエタノールで拭いて次の手術の前にビーズ滅菌器に挿入されます。
20. 屠殺時、マウスはペントバルビタールナトリウム（; 55〜65 mg / kgを65mg/ml）で麻酔する。麻酔の適切な面が達成されると、胸腔が開かれます。
21. 心臓はまだ、寒い塩化カリウムを含む23ゲージの注射針と注射器を打っている（のKCl、30mMの）または2,3 - ブタンジオンmonoxime（BDM; 10mMのは）しながら穿刺するために心室の後基底領域を使用してソリューションのです心臓が拡張期で逮捕されるまで徐々にチャンバー内に注入。
22. 心臓が削除されると、PBSを含む注射器は逆行残っているすべての血液を除去するために心を洗浄灌流するために使用されます。急性試験の場合は、再灌流の期間の終了時に、LADは閉塞の原点で再連結される。 1パーセントエバンスブルーを含む溶液は、大動脈に注入されます。心臓が抽出されると、それは、1％2,3,5 -トリフェニルテトラ塩化物中でインキュベート、同じ厚さの3つのセクションに横方向に切断し、形態学的解析¹¹の結像される。慢性毒性試験のために、心臓は、その後ルーチンの手順にしたがって処理して組み込み、固定液に浸漬する。スライドはその後組織学的に染色され^{、9,10,12（}サイオン、NIHイメージJ、またはイメージプロプラスを使用）形態学的解析のために撮像することができます。

代表的な結果：

正しく完了したら、マウス（雄：年齢8〜10週間、22〜28グラム、女性：年齢10〜12週、20〜26グラム）の生存率は以下のとおりです。以上、急性虚血/再灌流と虚血プレコンディショニングの実験では90％以上恒久的な動脈の結紮の研究で85％、および心筋内注射のための約80％。初期の損傷がより容易に目に見える代謝の変化ではなく、構造的なことですので、虚血/再灌流における梗塞サイズの決定と虚血プレコンディショニングの実験がLADで提供されていない心臓を灌流される大動脈に1パーセントエバンスブルー色素を注入することによって実行されます（図1A）。心臓が削除され、横方向に半分に切断されると、組織は梗塞サイズ（図1B）を測定するために2,3,5 - トリフェニルクロリドの1％溶液中でインキュベートされる。領域が同じ倍率で撮像さマイクロメータを使用して較正することができますサイオンやNIHイメージソフトウェアを使用して測定されます。これらの数値は、リスク/左心室と梗塞のリスクが¹¹でサイズ/エリアで面積を計算するために使用されます。違いは体重と心臓の大きさとそのケアの変化をもたらすことができる株は、比較のために心臓重量、体重、または脛骨の長さにこれらの対策を正規化するために注意が必要です。

このような壊死などの総構造変化、減肉、および心室拡張の恒久的な動脈の結紮の結果。左心室への相対的な梗塞サイズおよび壊死に対する治療および/または時間の効果の比較、チャンバ領域、永久閉塞モデル（図2A）の隔壁と左心室自由壁の厚さもサイオンやNIHのイメージングを使用して測定することができます。ソフトウェア。 picrosirius赤色/緑色で速く（図2B）とコラーゲンの染色は、壁の補強^8-10の機能的な指標に相関insterstitial線維症を測定するために使用することができます。図3の画像は、恒久的な動脈の結紮は、次の心臓の国境地帯に注入6ulソリューション（エバンスブルー）の分布を表します。それはtransmurallyも基地に向かってだけでなく、けがの方向に進行していることに注意してください。

図1。 A.エヴァンのブルーは前に切除の大動脈に注入する。このイメージは、心臓（ステンドグラス）や閉塞部位（非染色）の潅流領域を示す。B.エヴァンのブルーとTTCは、急性虚血/再灌流傷害に続く染色。これはunoccluded地域だけでなく、代謝的に実行可能な組織のTTC染色（赤）を染色した青色色素の分布を示す代表的な画像（20倍）です。壊死領域が染色されないので、これらは（概説）薄いままです。

図2。 A.ヘマトキシリンおよびエオシン染色。これは、4日後に心筋梗塞で梗塞領域を介して横方向に切断マウスの心臓（20倍）のH＆E染色の代表画像（20倍）である。 *は、組織の壊死を示し、矢印のポイント肉芽組織に、RV =右心室とLV =左心室。B. Picrosirius赤色と緑色で速く染色。これはpicrosirius赤/ポストMI 4週間でのマウスの心臓の断面の高速グリーン染色の代表画像（​​20倍）。細胞質の汚れの緑とコラーゲン線維が赤です。

6ul心筋内注射後図3。エバンスブルー色素染色の分布。これは、すぐに冠動脈結紮（12倍）以下の国境地帯で6ul心筋内注射した後、心臓全体にエバンスブルー色素のグローバルおよび経壁分布を示す代表的な画像です。

ディスカッション

冠状動脈性心臓病の疫学的および財政的に重要な公衆衛生上の問題であり続けている。かなり基本的な研究はまだ怪我して改造を続行するメカニズムとそれらがどのように臨床使用するために開発される場合に潜在的な治療法はこれらのプロセスを調節することを理解するのに必要です。げっ歯類は、最も一般的に使用され、遺伝子改変マウスの広い範囲が利用可能なこの種のより魅力的なモデルになりますされています。

マウスや他の種の違いがありますが、マウスモデルに多くの利点があります。簡単な解剖スコープまたは虫眼鏡を使用しても点灯条件は、血管を容易に見ることができるようになります（血管系の詳細な肉眼解剖学のために、サルト- Tellez らを参照してください。、2004 ^13）。 25グラムのマウスの全血液量が2ミリリットル¹⁴よりも小さいので、手術後の死亡のリスクを減らすために、それは大型船を切断することを避けるために非常に重要です。過度の出血が発生した場合には、圧力やピンポイントの焼灼の穏やかなアプリケーションは、出血を止めるために使用することができます。

この手順は、さまざまな方法で変更することができます。例えば、マウスは、イソフルラン、ケタミン/キシラジン、またはペントバルビタールナトリウムと適切な選択はプロトコル^{15から18まで}の期間によって決定されるを使用して麻酔することができます。つま先-ピンチの反射は麻酔の深さの最も一般的に使用されるインデックスです。さらに、長期生存の確率を向上させるために、いくつかの研究者が致死性不整脈^19,20の発生率を減らすためにリドカイン等の抗不整脈薬を使用するしかし、それは、これは最近、急性の抗アポトーシス特性を有することが示されていることを考慮する必要があります。モデル^21。また、手術後の痛みを軽減する、そのようなブプレノルフィンなどの鎮痛薬は、手術^{3,16,17,22,23}後の最初の48時間に投与することができる。 （特に長いプロトコルのため）手術中の体温を維持するために、加熱パッド付きシリーズの直腸プローブは、多くの場合、等温パッドの代わりに使用されます。永久的な閉塞のため、梗塞の大きさは、合字の位置を調整することによって変更されることがあります;閉塞（s）と再灌流（s）の持続時間は変更することができます：虚血/再灌流および/または虚血前またはpostconditioning用と心筋内注射（例えば、細胞、蛋白質）のために,1 - 3注射の場所が存在することができ、注入あたりの体積は15μlの²⁴まですることができます。細胞が注入されている場合は針の内径は、シェアーリングを避けるために十分な大きさであるので、（通常は^{26〜30）5,25,26を}使用するニードルのゲージは、細胞の大きさに基づいて選択する必要があります。手術によって引き起こされる炎症性プロセスによる困惑を避けるために、いくつかの研究者は手術^27から29の後の任意の時点で閉胸のマウスの心臓を閉塞し、reperfuseにex vivoで操作されるスネアを使って報告している。さらに最近では、ガオら ^30は、一時的および永久的な閉塞が換気を必要とせずに実行できると、いくつかの研究室が閉まる胸心筋内注射^25,31を実行するために超音波を使用し始めていることが示されている。

マウスでは冠動脈を結紮することの実現可能性を実証する最初の研究、1954年³²にジョンズとオルソンによって公開されて以来、多くの人はこのモデルを採用し、心筋障害とリモデリング^3,33-45のさまざまな側面を研究するためにそれを変更しました。サイズ、生殖能力、購入とメンテナンスのため、比較的少ない費用の点でマウスの性質は、この種の生理学的および病態生理学的研究の幅広い魅力的なツールになります。 in vivoでの進歩^46から49 のイメージング技術の微細化だけでなく、大規模ゲノミクスとプロテオミクスを実行し、分析することを意味し、薬剤のスクリーニング、細胞ベースおよび/ ​​またはタンパク質の治療だけでなく、生体^50から64の効果、組み合わせユビキタスまたは組織特異的トランスジェニックやノックアウト/変異マウスがもたらす遺伝子操作のますます広い範囲で、心筋梗塞のマウスモデルは、間違いなく急性心筋傷害と長期的なリモデリングを評価する上で貴重なツ​​ールであり続けるでしょう。したがって、確実にかつ再現性これらの実験を行うためにできることで疑う余地のない価値があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ロングヴァンナ剪刀	George Tiemann & Co.	160-159
マイクロ解剖用剪刀	George Tiemann & Co.	160-161
ピンセット – 直型、1x2歯	George Tiemann & Co.	105-205
メスハンドル #3	George Tiemann & Co.	105-64	#10 滅菌ブレード
ピンセット – 半曲型、ギザ付き	George Tiemann & Co.	160-19
組織剪刀	George Tiemann & Co.	105-410
カストロビエホ持針器	Miltex Inc.	18-1828
クック眼瞼開瞼器	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Germinator 500 ビーズ滅菌器	Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase 等温パッド	Braintree Scientific, Inc.	39DP
ハミルトンシリンジ - 25μl	Hamilton Co	80430
30G 鋭角針	Hamilton Co	7803-07
ベンチレーター	Kent Scientific	TOPO