ゼブラフィッシュ胚におけるアルキンタグ付き糖鎖の迅速、非侵襲的、および堅牢なラベリングを可能にするクリックケミストリーベースの方法が記載されている。後期原腸形成の段階におけるゼブラフィッシュ胚の包絡層におけるフコシル化糖鎖は、本研究では画像化した。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
in vivoでのイメージングの糖鎖は、最近、アジドまたはアルキンタグ付き単1、2細胞または生物を処理することにより、bioorthogonal化学レポーターの戦略を使用して有効になっている。糖鎖生合成機構によって処理される変更された単糖類は、細胞表面の複合糖質に組み込まれています。 bioorthogonalアジドまたはアルキンタグは、可視化用蛍光プローブと共有結合を許可する、または濃縮およびglycoproteomic分析のための親和性プローブと。のエンベロープ層のフコシル化糖鎖を標識する）GDP - 5 - alkynylfucose（GDP - FucAl）、2と1細胞期胚の1）マイクロインジェクション：このプロトコルは、一般的に含むゼブラフィッシュ胚におけるフコシル化糖鎖の非侵襲的イメージングに使用する手順について説明します。共焦点顕微鏡3で生体適合性銅（I）触媒によるアジド-アルキン付加環（CuAAC）、及び3）イメージングを経由してアジド共役フルオロフォアとゼブラフィッシュ胚。方法は、ここで説明容易にゼブラフィッシュを開発する際に、他の生物において、糖鎖、シアル酸4とN -アセチルガラクトサミン5を含むなどの糖鎖、6の他のクラスを可視化するために拡張することができます。
プロトコル
1。卵の回収とDechorionation
- 収集と35mmのペトリ皿にゼブラフィッシュ卵を転送、できるだけ多くの水のように削除してから、E3胚の培地で1 mg / mlのProneaseのE（5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMの塩化カルシウム2 · 2H 2 O、0.33 mMのマグネシウムを追加する絨毛膜を消化するために4、pH = 7.4）で。
- 3-5分後、魚の水（1リットル当たり60mgの"インスタントオーシャン"蒸留H 2 O）で満たされたビーカーに皿をマージし、穏やかにビーカーに卵を移すと、卵が水の中に"落ちる"ことができます。
- 魚の水と卵を3回すすいでください。ほとんどの卵は、それらの絨毛膜から解放されます。
- ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを用いて、E3胚の媒体が充填さアガロースコートしたペトリ皿にdechorionated卵を移す。
2。 GDP - FucAlとマイクロインジェクション
- 報告されたプロトコル7次の注入の料理を準備します。
- E3胚の媒体が充填注入皿にdechorionated卵を移す。
- 針を準備し、2μL注入液で読み込みます。このソリューションでは、....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
イメージング生体分子 in vivoで母国の環境でそれらの生物活性の重要な洞察を提供する。このビデオでは、我々はゼブラフィッシュ胚の包絡層におけるフコシル化糖鎖の標識がGDP - FucAlとBTTESを介した生体適合性CuAACを介して第二段階の蛍光団の共役による1細胞期胚をマイクロインジェクションすることによって実現される方法を示しています 3。堅牢な標識は、2〜3分以内に達成することができる、とラベルの付いた糖鎖は2.5 HPFには早くも検出可能である。重要なことは、GDP - FucAlの単回投与は、96 HPFまで検出可能なアルキンに依存した蛍光シグナルを得ることができる。同じアプローチは、2つの連続したCuAACを経由してゼブラフィッシュの開発にアルキンタグ付きfucosidesの人身売買を監視するために多色タイムラプスイメージングの実験に拡張することができます。しかし、ラベリングはクリックするだけで化学試薬の低い組織の浸透の深さに起因する胚盤の包絡層で実現されます。固定と透過性代謝GDP - FucAlで処理胚では、我々としてもインテリアの身体部分の.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
と医学のアルバートアインシュタイン大学からスタートアップ資金、この作品は、部分的に国立衛生研究所（RDSへ3U54AI057158 - 06S1 PWにGM093282）によってサポートされていました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | |
| 硫酸銅（II）五水和物 | シグマアルドリッチ | 203165 | |
| のAlexa Fluor ® 488アジド | インビトロジェン | A10266 | |
| デキストラン、Alexa Fluor 594の | インビトロジェン | D - 22913 | |
| （+）- L -アスコルビン酸ナトリウム | シグマアルドリッチ | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic酸 | アクロスオーガニック | 164060010 | |
| ガラス底マイクロウェル皿 | マテック | P35G - 1.5 - 14 - C |
参考文献
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
