非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。
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サマリー
要約
非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（μCT）となっている断層の技術によって達成することができます。
高解像度μCTは、ex - vivoで生体試料1、2の3次元検査のための非常に多目的な、まだ正確な（分解能1〜2ミクロン）技術です。電子線トモグラフィーとは対照的に、μCTは4cm厚さのサンプルまでの検査が可能になります。組織の週に比べてこの手法は、測定のわずか数時間を必要とします。さらに、μCTは、2D stereologicモデルに依存しないので、それは補完可能性があり、いくつかのケースでも、両方の時間がかかり、破壊的な組織学的方法3、4を 、置き換えることができます。 μCTでサンプル調整と位置決めが簡単ですし、逆に構造に影響を及ぼす可能性のある高真空や低温を必要としません。サンプルが配置され、シンチレータと正確なCCDカメラを含むmicrofocused X線源と検出器の間に180 °または360 °回転させ、それぞれの角度は2次元画像が取得されますし、ボリューム全体が1つを使用して再構築されています別の使用可能なアルゴリズム5-7。 3D分解能は回転ステップの減少と共に増加する。現在のビデオプロトコルは、高解像度でのイメージングに続いて、サンプルの準備、固定化とポジショニングの主要なステップを示します。
プロトコル
1。サンプルの準備
- 検討する組織を抽出した後、石灰化組織は、楽器に配置して撮像することができます。画像にマウスの大腿骨1つは、次の手順に従ってください。
- C57/BL6胚18.5日postceutus（E18.5）から死後の足を投稿取り外します。
- エポキシ樹脂または他の接着剤を使用して、ポリスチレンのピペットチップ（20〜200μl）の狭い方の端をシールし、作業バッファ（PBSまたは他の）で先端を埋める。
- しっかりと先端に足にフィットし、パラフィルムのシートを持つもう一方の端をシール。
- 適当なホルダーにピペットチップを置き、第3章からプロトコルに従ってください。マウスの足の胚から大腿骨を可視化するため、楽器は40 KV、200μAを設定されています。 8μ解決のために4倍1000投影画像は、取得する必要があります。
- 非石灰化組織は、8,9、多くの利用可能なプロトコルのいずれかを使用して目的の組織のX線の減衰量を増加させるために、最初に固定して染色する必要があります。ラットの肺と同じようなサンプルについては、準備のプロトコルは、次のとおりです。
- ヌードラットの肺の非小細胞肺癌（NSCLC）NCI - H460のOrthotopical注入
- 肺癌の結節は、移植から4週間に検出され始める
- ラットを犠牲にし、直ちにヘパリンと混合生理食塩水でそれを吹き込む
- 気管支循環を染色するために左心室にMicrofil（Flowtech）の希釈溶液、（化合物の溶液2 ml、希釈剤と硬化剤0.3mlを3mlの）のにそれを注入する
- ラットの肺と心臓を抽出
- 50 mlのプラスチック製の試験管にしっかりとフィットして、サンプルを（プロトコルの第2章を参照）固定化
- チューブの底にエタノールで減衰布を配置することにより、飽和エタノールの大気を作成する
- 楽器のホルダーに接着剤やスクリュー管
- イメージングパラメータを（3章）の設定に進みます。ラットの肺の完全なイメージングのためのソースは、40KV、100μAに設定されています。 16μ解像度を達成するために、ひとつは0.5倍の倍率で2500投影画像を取得する必要があります。
2。サンプルの固定化
高分解能で、測定時の試料位置の変化を避けることが大切です。このため、サンプルはしっかりとそのサイズに合うプラスチックの受信者に固定されています。ポリスチレンのピペットチップ、プラスチック製パスツールピペットまたは特別に作られたプラスチック製のホルダーはこの点で使用されています。実験的な要件によると、試料は空気中で調べることができますまたはエタノールまたは緩衝溶液に浸漬。典型的な固定化と楽器のマウス胚の脚部の最終的な位置決めは、図1に示されています。
図1。マイクロCT測定器で、マウス胎児の足の最終的な位置決め。
3。取得パラメータを設定する：X線の電圧と電流、CCDの露光時間
- ホルダーに入れ、試料は測定器の回転ステージに置かれている
- 最初のX線画像は、電圧と電流を任意に設定して取得されます。
- 画像が暗すぎる場合は、1つは、最初の光子の数を増やす必要がありますので、電流が少し増加する。これが十分でない場合、一つはX線管の電圧、すなわち、わずかにX線光子のエネルギーを増やす必要があります。
- 画像が明るすぎる場合は、まず、電圧、電流を小さくする必要があります。
- 画像の明るさは、ビニング増加させることができる。 2のビニングでは2x2のピクセルの各行列の和をとるのに対し、1のビニングでは、考慮に画像の各ピクセルの輝度を取ります。画像はビニング1の場合と比べて約4倍明るくなりますが、半分の解像度を持つことになります。
- 最適な明るさを設定した後、その人が側に最高のコントラストと別の側の実験の合理的な期間の間に妥協するカメラの露光時間を最適化する必要があります。
- 特に低吸収サンプルの画像、、のコントラストは、主に低エネルギーの光子のこと、光子束を低減するフィルタを、使用することによって改善することができます。
4。サンプルの位置決め
- 作業倍率を選択します。可能な選択肢は、0.5倍4倍、10倍、20倍と40倍です。ビューのフィールドには、増加倍率で減少する。
- X線源と試料の間に、サンプルと検出器間の距離を設定して、ビューの最適な解像度とフィールドを取得します。サンプル距離にソースを大きくすると、ビューのフィールドを減少させ、分解能を向上させます。検出器の距離にサンプルが逆の効果が得られます。
3Dで見ることが全体のフィールドは、に存在する必要があります全画角で投影像。一つは、異なる角度で試料を回転させることによって、回転軸にできるだけ近いサンプルを持って来ることによって、これを確認する必要があります。このため、一つには、次の手順に従う必要があります。
- 0度で画像を撮影し、-20℃でサンプルを回転させる。目的のボリュームが横方向にずれている場合、片方が回転軸を再配置することによって、位置を修正する必要があります。
- 補正後は、サンプルは別の角度で回転させることで、興味のある分野は、-90から90度までのすべての角度で画像の内側になるまでの位置は、再び修正。
5。高分解能の断層像
- 測定中、試料は一度に小さな角度によって、それぞれの角度one投影画像で回転が行われます。画像の総数は常に片側に目的の解像度と別の側面で測定し、ファイルのサイズの時間との兼ね合いで決まります。図2に示すように、一つ一つの突起は別の上の1つを重ね合わせ、サンプル中のすべてのスライスが含まれ、したがって、試料の3次元構造を明らかにすることはできません。
図2。 0 °（）、45 °（B）と90 °（C）の回転角度でのラットの肺の投影画像。
- 唯一の少なくとも-90から90度の間で投影画像を撮影した後、一つは、サンプルボリュームの再構築に進むことができます。再建には、使用するソフトウェアのおよび予測の数の応じて、10分、2時間かかります。再び、3D画像の最終的な品質は、目的の解像度と一費やすしたい時間と結果のファイルのサイズとの兼ね合いで決まります。
6。画像スケールのキャリブレーション
再構成画像のピクセルのレベル（値）は、その画像に対して一意です。つの異なる画像を比較するために、独自の輝度スケールは、各画像に課されなければならない。このため
- サンプルと同じ実験条件を使用して、標準ファントムによる断層撮影を実行します。
- ファントムについて得られた値を使用してサンプル画像をキャリブレーション。最も一般的なスケールはハンスフィールド（またはCT）のスケールです。 4倍の場合は15,000（水またはPBS用）のバックグラウンドの値を0に置き換えられ、骨のための35,000の最大値が3000の標準のハンスフィールド値で置き換えられました。他のピクセル値は、それらの制限に基づいて線形補間または外挿に起因する。
7。画像処理と解析
高解像度の画像を取得した後、一つは画像解析ソフトウェアを使用して関連情報を抽出する必要があります。使用するソフトウェアパッケージは、非常に大きなファイル（最大20Gbのまで）で動作するように設計する必要があります。
8。代表的な結果
胎生18.5（E18.5）のC57/BL6マウスからの大腿骨の表現 - 四日間鉱化プロセスの開始後は、図3に示します。鉱物層は軟組織がこの準備に表示されなくなってから、（白）はっきりと見える。我々は4倍の線形倍率で1000投影画像を取った。最終的な分解能は8ミクロンです。図1に示すようにボリュームレンダリングの慎重な分析は、骨の体積分率（石灰化組織によって占有されている骨の体積の割合）が0.18であることを示しており、骨密度は、723ミリグラム/ cm 3である。これらの値は、私たちは開発の他の段階にある骨で、この構造体を比較することができます。
図3。マウスの大腿骨の胚の3D画像の別の表現。横（断面）は（A）、矢状（メディオ横ずれ）セクション（B）とボリュームレンダリング（C）のスナップショットが表示されます。
図4は、非小細胞肺癌（NSCLC）NCI - H460との同所移植した12週齢の雌のヌードラット（RNU）、、の肺の3次元画像を示しています。 2500投影画像は、16ミクロンの最終的な分解能を確保する、0.5倍の線形倍率で撮影された。画像は、（ダウン20ミクロンの直径の）Microfilステンド血管を示しています。画像解析の4週間注入した後、複数の癌結節が形成されていることを示しています。彼らは、肺気量（17％）のかなりの部分を覆っている。肺染色のほとんどは、腫瘍の周辺部で発見された。著しく、図4Bに示すように、いくつかの血管がそのボリュームの約3％の予備的分析によれば、カバー、結節の内部にも存在しています。
図4ラットに成長する癌結節の三次元画像肺。ボリュームレンダリング（）と体積の断面（B）のスナップショットが表示されます。癌の結節は、矢印でマークされます。
映画は1。図1のマウスの大腿骨のボリュームレンダリングが。 映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。
図2のラット肺の2。ボリュームレンダリングムービーが 。 映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。
映画（3）肺を介してシリアルセクション。結節は、スライスの大部分のグレーの領域として表示されます。 映画を見て、ここをクリックしてください。
ディスカッション
胎生18.5（E18.5）のC57/BL6マウスは、4日間の鉱化のプロセスの開始後です。開発のこの段階で、将来の骨は、明らかに図3に見られるように、石灰化osteoidsの多くのレイヤーで構成されています。この時点で、一つは鉱化組織が少なくサンプルの処理を必要とするさまざまな楽器と低い解像度で可視化できることを強調してください。より高い分解能を提供するだけでなく現在のプロトコルは（とそれに使用されるマイクロCT機器）、測定のための最善の幾何学的パラメータを選択するため、最高の柔軟性を提供しています。
図4の結果は、同所性肺癌の動物モデルにおいて、ヒト非小細胞肺がんは、血管と血管新生の募集を誘導できることを示している。我々は、肺組織はどちらも移動されなかったことを考慮し、またその形状は、測定中に変更されています。ユーザーは、断層撮影中にこのような変更を避けるために、特別な予防策を講じる必要があります。一部のサンプルについては、特に柔らかい組織のために、一つは、測定中に完全に試料を固定する特殊な保持装置を構築する必要があります。残念なことに腫瘍の周囲に造影剤の高い漏れの存在は、末梢血管の信頼性の定量化を防いだ。その結果、画像ははっきりとムービー2と3に存在する、特に端でいくつかの染色剤によって汚染されます。我々は、この流出を防ぐことができなかったが、その大きさ、形状及び内部の血管の存在を含む癌の結節、に関する有用な情報には影響しませんでした。私たちは、明らかに腫瘍の内部にもいくつかの血流が存在して、少なくともここで検討した気管支循環のために、末梢血液の供給が腫瘍血流に関与すると結論付けている可能性があります。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
研究は、アーヴィングと科学のワイツマン研究所のナノとバイオナノイメージングのためのChernaモスコウィッツセンターで実施されました。
我々は、このプロトコルの設計と実行の援助の彼女Orna Yegerに感謝しています。
材料
画像取得のために我々はマイクロXCT - 400 Xradia、コンコード、米国で生産さmicrofocussed X線断層撮影システムを使用している。
画像が処理すると、ImageJ（NIH、米国）、Avizo（VSG、フランス）とMicroView（ゼネラルエレクトリック、米国）のソフトウェアパッケージを用いて分析した。使用可能な任意の画像解析ソフトを代わりに使用することができます
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