方法は、蛍光イメージングのための別の脊椎動物種から単生きた光受容細胞の調製のために説明されています。方法は、画像にそのようなNADHやビタミンAなどの内因性蛍光体の蛍光を使用し、又はCaに敏感な外因的に添加蛍光色素のことができる 2 +または他の要因。
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この記事について
サマリー
要約
脊椎動物の網膜では、光伝達、電気信号に光の変換は、桿体と錐体視細胞1〜4で行われている。桿体は薄暗い光のビジョン、明るい光の円錐形のための責任があります。光伝達は光受容細胞、視色素、一次光検出器の高濃度が含まれている特殊なコンパートメントの外側の部分で行われます。視覚的な色素は、発色団、11で構成されて-タンパク質、オプシンに添付された、 シスレチナール。すべてのトランスへのシス -視覚色素によって吸収された光子は、11から発色団を異性化。この光異性化は、膜電位の変化で絶頂に達すると電気信号に光刺激の伝達をもたらす反応のカスケードを開始する視覚色素のコンフォメーション変化をもたらす。光刺激から細胞の回復は、光によって活性化中間体の不活性化、および膜電位の再確立を行います。のCa 2 +は、光情報伝達に関与する酵素のいくつかの活性を変調し、その濃度は、光刺激により低減されます。この方法では、Ca 2 +は背景光の光刺激とその適応からの細胞の回復において重要な役割を果たしている。
全トランス 5月7日にシス発色団-回復のプロセスの別の本質的な部分はその11の光異性化による光検出の際に破棄されている視覚色素の再生です。この再生は、アポタンパク質のオプシンを残し、光活性化顔料によって全トランスレチナールのリリースから始まります。リリースされたすべてのトランスレチナールは急速に全- トランスレチノールにNADPHを利用する反応で減少し、オプシンは新鮮な11で結合している-視覚的な色素を改革するために外側のセグメントに持ち込まれた網膜シス 。全- トランスレチノールは、専門のキャリアInterphotoreceptorレチノイド結合タンパク質（IRBP）で外側のセグメントで構成し、隣接する細胞へ搬出される。
単一視細胞の蛍光イメージングは、それらの生理学および細胞生物学を研究するために使用することができます。 のCa 2 +感受性蛍光色素8月12日だけでなく、内側のセグメントのCa 2の役割のCa 2 +ストアを明るみに詳細に外側のセグメントのCa 2 +の変化と応答の間の相互作用を調べるために使用することができます+ホメオスタシス13,14 。蛍光染料はまたのMg 2を測定するために使用することができます+濃度15、pHを、水性および膜のコンパートメント16のトレーサーとして。最後に、全- トランスレチノール（ビタミンA）の固有蛍光が単一の視細胞17から19で、その形成と除去の速度を監視するために使用することができます。
プロトコル
1。 Sylgardに覆われた皿、実験チャンバー、そり及びその刃の準備
- Sylgardのエラストマーでコーティングさ35ミリメートルファルコンペトリ皿は、単一の視細胞を得るために単離網膜の適切なチョッピングのために必要とされる。エラストマーは、供給者の指示と少量の層で、その底部をカバーするためにそれぞれの皿に注がれるにしたがって調製される。皿はコーティング後にカバーを取り付け、それらを保存する。数日後にはエラストマーが硬化すると料理が準備が整いました。
- 彼らはイメージング実験の過程で固定化されるように孤立した光受容体は、実験室の底に固執する必要があります。これは、ポリ- L -リジンまたはポリ- L -オルニチンでコーティングすることによりチャンバーの底を実現しています。室ごとにいずれかの0.01％溶液200μLを追加し、ほこりからそれらを保護するためにペーパータオルでチャンバーを覆う。解決策が乾燥した後、密閉ボックス内の蒸留水とストアを持つチャンバーを洗浄する。 2週間以内でご使用ください。
- 実験終了時に室をクリーニングするには、油浸レンズと細胞の破片から任意の油を除去するために100％エタノールでそれらを洗ってください。細胞破片を除去するために、綿棒のアプリケーターを使用し、慎重にチャンバーの底をスクラブ。その後、蒸留水で洗浄し、再塗装の前にチャンバーを乾燥させる。
- 金属カッターで小片（8つのブレードから）に両刃のカミソリの刃をカット。
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ディスカッション
健康な単離された細胞が得られない場合、問題は、網膜の分離や健康状態、またはそのチョッピングのいずれかである。一般的に、眼と硝子体の前部を除去した後、網膜は容易に色素上皮をオフに持ち上げる。表示されない場合は、アイカップの周囲から始まるoffにはがしてみてください。それは分離することは依然として困難である場合は、おそらく可能性は、動物が時間の十分な期間のために暗順応されていない、または赤色の光が明るすぎるということです。動物のための適切な暗順応、および暗赤色灯を確認してください。網膜の桿体の存在は、単離網膜の色をチェックすることによって簡単に知ることができる。網膜の小片をカットし、室内の照明下で観察することができる独立したペトリ皿にそれを転送する。桿体を含む網膜の部分は明るい赤色（ロドプシンのために）急速にフェードことがあります。無色の部分は、ロドプシンの不在を示し、それゆえ桿体のでしょう。これは、色素上皮から網膜の不適切な分離や不健康な網膜が原因である可能性があります。このようなケースでは、動物の健康とその適切な暗順応を確認する必要があります。健康な網膜のではなく、健康な単離された細胞が得られる場合、問題はチョッピングで最も可能性があり.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
NEI助成金EY014850によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 暗い部屋（100〜150フィート2） | |||
| レッドライト19 | オンラインストア | ||
| 赤外線光源と赤外線画像ビューア | FJW光システム、（株） | ||
| 解剖顕微鏡19 | 赤外線視聴者が装備 | ||
| 遮光ケージ19に囲まれた落射蛍光顕微鏡 | |||
| 解剖ツール（はさみ、ピンセット、ブレードホルダー） | Robozまたはファイン科学ツール | ||
| Sylgardエラストマー | エセックス（シャーロット、ノースカロライナ州） | Sylgard 184エラストマーキット | |
| ポリ- L -オルニチン（0.01％） | シグマアルドリッチ | P4957 | |
| ポリ- L -リジン（0.1％） | シグマアルドリッチ | P8920 | 0.01％に希釈する |
| 実験チャンバー | ワーナーインスツルメンツ（ハムデン、コネチカット州） | D3512P | |
| ペトリ皿、プラスチックピペット | フィッシャーサイエンティフィック |
参考文献
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Ko....
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再版と許可
