この全体のマウントその場でハイブリダイゼーションプロトコルは、E8.5、E11.5日齢のマウス胚において遺伝子発現研究のための再現性の高品質な結果を確保するための重要なステップを説明します。
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この記事について
サマリー
要約
in situハイブリダイゼーションホールマウントは、胚における遺伝子発現パターンを定義するための非常に有益なアプローチである。 in situハイブリダイゼーションの手順で 、長く技術的に一括して最終結果の質の向上に寄与する複数の重要なステップで求められています。 このプロトコルを詳細にプローブのラベリングとパフォーマンスを最適化するためのいくつかの重要な品質管理手順を説明します。全体的に、我々のプロトコルは、詳細な説明を提供しています再現性よく高品質な結果を得るために必要な重要なステップの。まず、PCRによって生成されたDNA鋳型のインビトロ転写を介して、ジゴキシゲニン（DIG）標識RNAプローブの生成を説明します。我々は、量、整合性とDIG標識プローブの比活性を決定するために、3つの重要な品質管理検定法を説明します。これらの手順では、全体のマウス胚における内因性mRNAを検出するために十分な感度のプローブを生成するために重要である。加えて、我々はin situハイブリダイゼーションのためのE8.5-E11.5日齢のマウス胚の固定とストレージのための方法について説明します。そこで我々は、非特異的なプローブハイブリダイゼーションを削除するには、ハイブリダイゼーション条件、ハイブリダイゼーション後の洗浄とRNase処理の詳細は、続いて再水和された胚の限られたプロテイナーゼK消化のための詳細な方法について説明します。 AP標識抗体が標識されたプローブを可視化し、内因性の転写産物の発現パターンを明らかにするために使用されます。代表的な結果は、成功した実験と典型的な次善の実験から示されています。
プロトコル
1。 インビトロ転写を介したリボ生成
- in vitroでの転写テンプレートのPCR産物を調製した。
- その5 '末端におけるファージ転写プロモーター配列を有するPCRプライマーの設計。
注：プロモーター配列は、センス鎖のPCRプライマーの5 '末端に追加されたセンスプローブを転写するために使用され、アンチセンスPCRプライマーの5'末端に追加されたプロモーター配列はアンチセンスプローブを合成するために使用されます1-3。我々は唯一のコアプロモーター配列対コアプロモーターに加え、追加の5 '配列を含むテンプレートを含むテンプレートの間に転写効率に差が検出されていない。このメソッドは、T3、T7およびSP6ファージプロモーターと共に使用されています。
彼らは非特異的なハイブリダイゼーションおよびtherebをもたらすことができるので非常に遺伝子ファミリーメンバー又は高度反復配列の間で保存された配列は避けるべきであるyはバックグラウンド染色を増やす。高GC含量とプローブはT残基の失点はジゴキシゲニン分子間の立体障害のためにDIG-UTPの取り込みを制限することになると限られたジゴキシゲニンrUTP定款及びDNA鋳型配列を持つことになります。プローブの長さは300bpから1キロバイトの範囲で指定できます。しかし限り、上記の基準が満たされているように、通常より長いプローブは高い比活性を有する。
- その5 '末端におけるファージ転写プロモーター配列を有するPCRプライマーの設計。
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ディスカッション
このプロトコルで説明する方法は、さまざまなソースから適応し、ホールマウントE8.5-E11.5日齢のマウスの胚に最適化されています。脊椎動物の胚のin situハイブリダイゼーションホールマウントするための方法は、まず、1990年代初頭2,5-12で登場しました。このプロトコルは、主にアフリカツメガエル胚7,8と同様にマウス2,11のために開発された方法から脚色したものです。我々のプロトコルに重点の大部分はプローブの慎重な品質評価に配置されます。高品質を生成し、このプロトコルでは最古のステップによって決定高比活性RNAプローブが大幅にデータの質を向上させ、長期的には時間と労力のかなりの量を節約するには十分注意。我々のプロトコルはまた、ファージRNAポリメラーゼ転写のためのPCR生成されたDNAテンプレートの使用を含む。このアプローチでは、迅速かつ非常にスケーラブルです。それは、RNAプローブfoの多数の生成を有効にすることができますin situハイブリダイゼーション画面13から15 のr.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
この作品は、NIHの助成R21MH082360（BGC）とR01HD056315（NRM）と同様にジョージア大学によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| 名前 | タイプ | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| ジゴキシゲニン-11-ウリジン-5'-三リン酸 | 試薬 | ロッシュ | 11209256910 | |
| リボヌクレオシド三リン酸セット | 試薬 | ロッシュ | 11277057001 | |
| 放射性標識RNA精製用のクイックスピンカラム | 供給 | ロッシュ | 11274015001 | |
| T7 RNAポリメラーゼ | 試薬 | ロッシュ | 10881767001 | |
| SP6 RNAポリメラーゼ | 試薬 | ロッシュ | 10810274001 | |
| T3 RNAポリメラーゼ | 試薬 | ロッシュ | 11031163001 | |
| CTPは、[α-32P] - 800Ci/mmol 10mCi/ml、250μCiの | 試薬 | パーキンエルマー | BLU008X250UC | |
| DNase Iを換え、RNaseフリー | 試薬 | ロッシュ | 4716728001 | |
| 尿素、無色から白色の結晶又は結晶性の粉末 | 試薬 | フィッシャー | BP169-500 | |
| ゲルローディングバッファー | 試薬 | アンビオン | AM8547 | |
| ハイボンド-N +、アマシャム | 供給 | GEヘルスケア | RPN82B | |
| 紫外線Stratalinker 2400 | 機器 | ストラタジーン | ||
| ピロ炭酸ジエチル | 試薬 | シグマ | D5758-100ML | |
| ヘパリンナトリウム | 試薬 | アクロス | 41121-0010 | |
| 水中での過酸化水素30パーセント | 試薬 | フィッシャー·サイエンティフィック | BP2633-500 | |
| グルタルアルデヒド、8％のEMグレード | 試薬 | ポリサイエンス | 0/710 | 製造者の指示に従って、注意して使用すること |
| ブロッキング試薬 | 試薬 | ロッシュ | 11096176001 | -20℃で、5％の株式と店に確認します |
| プロテイナーゼK | 試薬 | ロッシュ | 3115852001 | |
| RNアーゼ | 試薬 | ロッシュ | 10109142001 | 作るとして-20℃で10 mg / mlの株式や店舗 |
| リボヌクレアーゼT1 | 試薬 | ロッシュ | 10109193001 | |
| ULtrapureホルムアミド | 試薬 | インビトロジェン | 15515-026 | |
| 塩酸レバミゾール | 試薬 | ICNバイオメディカル。株式会社 | 155228 | |
| トルラ酵母からリボ核酸、タイプVI | 試薬 | シグマ | R6625 | フェノール/クロロホルムを数回抽出し、沈殿させ、DEPC-dH2Oに再懸濁し、-20℃で保存 |
| 抗ジゴキシゲニン-AP Fab断片 | 試薬 | ロッシュ | 11093274910 | |
| BMパープルAP基質、沈殿させる。すぐに使用できるソリューションを提供します。 | 試薬 | ロッシュ | 11 442 074 001 | |
| 4mLの、クリア、クローズドトップ、ストレージバイアルコンビニエンスキット | 供給 | 国立科学 | B7800-2 | |
| シェイクN焼くハイブリダイゼーションオーブン | 機器 | Boekel科学 | 136400 | |
| 検確かテック | 供給 | Fisherbrand | 15から200-402C | |
| Paraplastプラス組織包埋媒質 | 試薬 | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| ピールウェイ使い捨てプラスチック組織埋め込み型 | 供給 | ポリサイエンス | 18646A | |
| Colorfrostプラス顕微鏡スライド | 供給 | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| 核ファーストレッド | 試薬 | シグマ | N8002 | |
| Cytoseal 60 | 試薬 | リチャード·アラン·サイエンティフィック | 8310から16 |
参考文献
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A.
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