の活動の定量化シス調節エレメント

1。エレクトロポレーションチャンバーの建設

1. 3.2ミリメートルのギャップ（ハーバード大学の装置＃45〜0105）（ 図2A）とmicroslide、BTXモデル453を注文。金属製のレールが完全にスライドの一番下に密封する必要があります。
2. プラスチック製のマイクロチューブのラックからハンドルをカットするドレメルツールを使用してください。長さの0.8センチメートル、高さ0.6センチメートル、幅0.3センチメートル（ 図2B）：それぞれ以下の寸法で5小さな長方形の部分にハンドルを切る。これらのプラスチック部分はmicroslideチャンバ内で個々のウェルを成形するために使用される再利用可能なスペーサーです。
3. 等間隔にmicroslideの金属のレールの間にプラスチック製のスペーサーを挿入します。スペーサーは、（ 図2C）ぴったりと収まる必要があります。
4. P200のピペットチップオフ先端をカット、3ミリリットル注射器に先端を合わせ、そして100％のシリコーンゴムの水族館シーラントなどで注射器を埋める。シーリング材とプラスチック製のスペーサーとの間のギャップを埋める。上ので気泡がシーラントプラグとmicroslideのベースとの間に形成しないことを底からのギャップを埋めるようにしてください。
5. スペーサを所定の位置に保持されるように、プラスチック製のスペーサーの上に金属の棒を置き、バインダークリップで固定ながらシーラントが乾燥する（ 図2D - E）。シーラントは、一晩乾かします。
6. バインダークリップ、金属製の棒、およびプラスチック製スペーサを（ 図2F）を取り外します。金属製のレールの上からシール剤をきれいにする外科用メスの刃を使用してください。 microslideを調べ、気泡がシリコンダムの下部に存在しないことを保証するために解剖顕微鏡を使用してください。地金が井戸の内部に露出するように井戸内に形成された可能性のあるすべてのシーラントフィルムを取り外します。水でよくものを記入し、水が隣接するウェル（S）に漏洩しないことを確認してください。すべての井戸について繰り返します。
7. 終了microslideは皿の側面の窓（ 図2G）に隣接する金属の棒とプラスチックの皿に収まり、電極は、最終的に金属の棒に添付されます。

2。 DNA調製

1. 氷上で1.5ml微量遠心チューブにプラスミドDNAを追加し、蒸留水で150μLにボリュームを起動します。複数のプラスミドを種が共存エレクトロ（ 例えば 、実験的DsRedを構成し、制御GFPコンストラクト）のために組み合わせることができる。チューブに加えるDNAの量を計算するとき、DNAのアリコートの最終容量が60μlになることを覚えておいてください。一般的に、各コンストラクトは0.5μg/μlの最終濃度で使用されています。
2. 15μlの3M酢酸ナトリウム（pH 5.2）と450μlの100％エタノールを加えることによりDNAを沈殿させる。ミックスに数回転倒やチューブをタップします。
3. 4でDNAをスピンダウン° C、30分間13200 rpmで、。 70％エタノールでペレットを洗浄し、4で再度スピンダウン° C、15分間13200 rpmで、。空気乾燥ペレットを半透明になるまで、約7分、その後、54μlの滅菌水に懸濁します。 6μl滅菌10 × PBS（pH7.4）およびミックスを追加。

3。アイコレクション

1. エレクトロポレーションチャンバーと70％エタノールを持つすべての機器を滅菌する。目のコレクションと解剖は組織培養フードで実行する必要がない一方で、あなたの手袋とエタノールと、プロシージャ全体で無菌状態を維持しようとベンチを消毒する。
2. 3ミリリットル培地一二つ35ミリメートル皿ごと：解剖の培地（：F12、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.29mg/ml L -グルタミン、および5μg/mlインスリンDMEMの1:1比）でペトリ皿を準備する6ミリリットル培地で60ミリメートル皿。このステップは、組織培養フードで実行する必要があります。
3. 新生児の頭頸部（生後0日目）70％エタノールで子犬マウスを消毒する。すぐにはさみで首を切ると滅菌100mmディッシュに頭を転送する。
4. 目を公開する小さなハサミで頭皮を切り取る。そっと軌道の外目をすくうために湾曲鉗子を使用し、そして解剖の培地を含む35mmディッシュに目を配置。それは、低電力で解剖顕微鏡下で目を削除すると便利かもしれません。
5. すべての目が収集されるまで、ステップ3.3および3.4​​を繰り返します。解剖しながら室温で解剖媒体で目にしてください。あなたは、DNAのアリコート3〜4の目が必要になります。

4。網膜切開

1. かみそりの刃と滅菌したプラスチック製トランスファーピペットのラッパーの両方を駆除するために70％エタノールを使用してください。それは全体の目を吸うことができるようにブレードを持つピペットオフ先端をカット。使用しないときは、プラスチックのラッパーでピペットを保管してください。
2. 35mmディッシュから60mmディッシュに片目を転送する。ハイパワーで、解剖顕微鏡下で、眼の表面から、そのような外眼筋や脂肪として、あらゆる組織を除去するために微細な鉗子を使用してください。その後、基地でそれをつまんで視神経を削除します。
3. 網膜を単離するために、小さな穴を開けないで私角膜輪部で強膜をn個。穴（網膜面に接線方向）に鉗子の両方のペアから一突起を挿入し、強膜/ RPEを開く引き裂く。アルビノマウスでは、強膜およびRPEは、均質なマットグレー色である網膜組織、に光沢のある相対的に表示されます。色素性マウスでは、RPEは黒です。場所でのレンズにしておきます。
4. 培地と他の35mmディッシュに切除した網膜を移動するには、転送ピペットを使用してください。
5. すべての目が解剖されるまで4.4手順4.2を繰り返します。
6. あなたがエレクトロの準備が整うまで、37℃の組織培養インキュベーターで網膜を保管してください。

5。エレクトロポレーションのための準備

1. 培地の35ミリメートル料理を準備します。エレクトロする各DNAのアリコートでは、解剖の培地と培養液の一皿（解剖の培地を加えた10％FBS）の一皿が必要に​​なります。適切な皿にラベルを付けます。
2. エレクトロポレーションの皿にチャンバーを洗浄するためにP200ピペットと滅菌1X PBSを使用してください。各チャンバーは60 -100μlの量を保持しています。各チャンバーの計3回洗浄する。
3. DNAのアリコートでチャンバーを埋める。任意の未使用のチャンバーは、60μl1X PBSで埋めなくてはなりません。エレクトロ皿に電極を接続してください。
4. 、電圧、30V、パルスの長さ、50ミリ秒、パルス、5の数、間隔、950ミリ秒、極性、ユニポーラモード、LV：エレクトロで以下の設定を使用してください。

6。エレクトロポレーション

1. レンズによって網膜を把握し、エレクトロポレーションチャンバーにそれらを転送するために微細な鉗子を使用してください。各チャンバーは3-4マウスの網膜（ 図3）を収容できます。
2. レンズは、正極に接続されている金属の棒に対して傾いているように、網膜を整列するために鉗子を使用してください。次の1つのチャンバーからのDNAのキャリーオーバーを避けるために、各転送後にキムワイプで鉗子を清掃してください。
3. すべての網膜が整列されると、エレクトロ上で"スタート"を押してください。小さな気泡は負極に接続されている金属の棒で形成すべきである。
4. 電極を外し、エレクトロの電源を切ります。
5. 静かにチャンバ壁から網膜を移動するにはピンセットを使用してください。
6. 解剖の培地を含む35ミリメートル皿にチャンバーから網膜を転送するために無菌トランスファーピペットを使用してください。
7. 各チャンバーの滅菌1 × PBSで3回洗浄し、滅菌水ですすいでください。 70％エタノールでスプレー皿。

7。文化のためのフィルタの網膜の配置

1. 培地を含む35ミリメートル皿に網膜を転送する転送ピペットを使用してください。
2. 滅菌6ウェル培養プレートのウェルにラベルを付け、3ミリリットルの培地で各ウェルを埋める。
3. 各ウェル中の培地の上に、ラウンドワットマンNucleporeフィルター、光沢のある面を上に配置するために滅菌ピンセットを使用してください。
4. 解剖顕微鏡下で、フィルタ、レンズ側のドロップダウンに網膜を転送するために無菌トランスファーピペットを使用してください。網膜の土地レンズ側を上にしている場合は、ピペットとそれを再度配置する試みとそれを拾う。一つのフィルタで4つ以上の網膜を配置し、それぞれの網膜の周囲の媒体の液滴は、他の液滴から別の状態であることを確認しないでください。他のプロトコルは、この手順⁹の前にレンズの除去を求めるが、我々は文化をそのままレンズと網膜のことに注意してください。
5. 37℃の組織培養インキュベーター（5％CO _2）の培養プレートを置き、8日、通常は、時間の所望の量のために成長する。培地交換は、より長い培養期間で必要になるかもしれないが、我々の経験では、培地を変更すると、8日間の培養期間中は不要です。

8。蛍光網膜外植片を採取し、flatmounting

1. 4％パラホルムアルデヒド/ 1X PBSで各ウェルの培地を交換してください。網膜は、フィルターに付着したままの場合、上と優しくフィルタオフ網膜剥離のフィルタを反転するにはピンセットを使う。 30分間パラホルムアルデヒド中でインキュベートする。室温で。蛍光を漂白避けるために、光から網膜を保護する。
2. 1X PBSで10分間二回網膜をすすぐ。
3. PBSの小さなドロップでスライドガラス上に網膜を転送するために使い捨てピペットを使用してください。彼らは、エレクトロポレーションサイドアップになるように、蛍光解剖顕微鏡下で、（ すなわち 、レンズ側のダウン）網膜を反転するにはピンセットを使う。
4. スライドの四隅に砕いたカバーグラス（直径1〜2 mm程度のガラス片）から作られた場所のガラス"足"、これらの足は、網膜のフラット化を防ぐ。それは足の網膜や休符を覆うようにスライド上にそのままガラスのカバースリップを配置。必要に応じて、スライドとカバースリップの間でより多くのPBSを追加するには、ピペットを使用してください。

9。 flatmountにおける蛍光のイメージングと定量化

1. 使用してください赤と緑のチャンネルの低消費電力（4X目的）での画像flatmounted網膜をするモノクロカメラを装備した蛍光化合物の顕微鏡。すべての網膜は、蛍光強度の比較を可能にするため、特定の蛍光チャネルに同じ露光時間で撮像されている必要があります。ピクセルが任意の画像では飽和していない、または他の正確な定量は不可能であることを確認してください。 TIFF形式のグレースケールで画像をエクスポートする。
2. ImageJのソフトウェア（1つの網膜（ すなわち ..、赤のチャンネルと緑チャンネル）に設定されている画像を開きますhttp://rsbweb.nih.gov/ij/ ）。このチュートリアルのために、緑色蛍光チャンネル（GFP蛋白質）は、実験内のすべての網膜全体で一定である制御構造です。赤色蛍光チャンネル（DsRedタンパク質タンパク質）は、網膜のセットごとに変化する実験的な構築物である。画像はグレースケールにする必要があります。
3. ImageJのでは、コントロールの緑のイメージを選択して、直径が100ユニット（分析/ツール/ ROIマネージャー/詳細/指定）に興味の円を指定します。合計8円を作成するには、この円を（ROIマネージャー/追加）重複。網膜とレンズ（ 図4A）を覆う領域の外側エッジを避けて、一様にエレクトロポレーションされている5つの領域を選択するために丸1〜5を移動します。また、網膜/バックグラウンドの蛍光を測定するためにレンズの外側3つの領域を（丸6-8）を選択します。赤のイメージを選択し、ROIマネージャーでボックス"すべてを表示"、および再チェックボックスをオフにチェックしてください。すべての8つの円が赤い画像に表示されます。すべての円はROIマネージャーの座標選択解除します。
4. 選択した赤いイメージで、関心のすべての円（ROIマネージャー/測定）の平均ピクセル値を記録し、測定結果1-8 1-5赤い網膜測定であると6-8赤のバックグラウンド測定される場合、表示されるはずです。緑のイメージを選択し、平均ピクセル値を記録してください。9-13緑の網膜の測定値であり、14〜16は緑の背景の測定値がどこの測定9-16は、表示されます。分析のためのExcelに測定データ（ 図5）にコピーします。
5. 赤と緑のチャンネルの両方で3つのバックグラウンドの測定値の平均。赤のチャネルの5つの網膜の測定値の各々から赤い背景の平均を引く、緑のチャネルの繰り返し。それぞれの網膜関心領域の場合は、コントロール緑色レベル（ 図5）に実験的な赤のレベルを正常化するために、バックグラウンドサブトラクション、緑を測定することによりバックグラウンドを差し引いた赤い測定を割ります。
6. 与えられたDsRedの構造（ 例えば 、網膜の時間当たり5回測定の3つの個別の網膜）のためのすべての正規化の測定値の平均値と標準偏差を決定する。定量的に異なる日に実施したエレクトロポレーションの結果を比較するためには、常にそれぞれのエレクトロポレーションセットの"標準"DsRedの/ GFPの降水量が含まれています。実験間の相対発現値は、このの発現レベルに正規化することによって比較することができる"標準的な。"

10。代表的な結果：

網膜表面の1 / 4に1 / 3（ 図4A）全体のDNA構築物（s）の式の中で良好なエレクトロポレーションの結果。特に桿体が効率的に形質導入されているので、この手法は、光受容体特異的なプロモーター活性（ 図4B）を定量化するための理想的です。我々は以前ロッド特有のRhoおよびGnat1座¹⁰からプロモーター変異体の範囲を定量化するこのアプローチを使用していました。私たちは、ほぼ300倍の範囲でプロモーター活性を定量化することが可能であることがわかった。

図5は、単一のエレクトロポレーション網膜からのサンプルデータセットです。この特定の例では、実験的な構造pNrl（1.1キロバイト）- DsRedを赤チャンネルで測定し、制御構造pNrl（3.2キロバイト）- GFPは緑色のチャネルで測定した。 pNrlのための完全なデータセット（1.1キロバイト）- DsRedの構造は、この方法で測定された6月9日の網膜から構成され、標準偏差はすべての値"GFPに正規化されたDsRedの"に基づいて計算される。我々はpNrlの発現レベル（1.1キロバイト）- DsRedのために比較された場合、例えば、pNrlは（0.8キロバイト）- DsRedのは、両方の構文は、同じGFPの制御（ 例えば 、pNrl（3.2キロバイト）とエレクトロされる必要がある- GFP）と同じ露光時間で撮像。標準DsRedタンパク質/ GFPエレクトロポレーション（ 例えば 、pNrl（3.2キロバイト）- DsRedの+ pNrl（3.2キロバイト）- GFP）それぞれの日に実行された場合。それは別の日に収集されたプールのデータに可能です。それぞれの実験的構造のため、正規化されたDsRedタンパク質レベルは、その後、"標準"（pNrl（3.2キロバイト）- DsRedの）の正規化されたDsRedタンパク質レベルに正規化される。

我々はここで説明するテクニックは、感光体CRES ^10,13の活性を定量化するために主に有用です。細胞型特異的シス調節活性はまた、双極細胞¹⁴と稀網膜細胞型で定量化されるが、これは、通常は定量化することに関心のある分野はむしろflatmount調剤ではなく、垂直断面で選択されている必要がありますできます。同じような光受容体と双極細胞のような複数の細胞型で発現を駆動するCRESの真です。実験手順はそうでない場合は類似しています。

図1網膜の外植片のエレクトロポレーション手順の概要。最初に、全体の目は、生後0日目仔マウスから単離され、網膜を（P1）解剖されています。第二に、網膜は、DNAとエレクトロポレーション（P2）を充填したチャンバー内に配置されています。第三に、網膜をフィルター上に置き、8日（P3）培養する。第四に、網膜の外植片は、固定スライドにマウントし、画像化される。蛍光強度をImageJのソフトウェア（P4）で測定されます。第五に、ImageJのデータは、種々のプロモーター（P5）の活性の違いを定量化するためのスプレッドシートプログラムで処理されます。

図2エレクトロ皿の建設。ハーバード装置、BTXモデル453（カタログ＃45〜0105）からA）無改造microslide室。 B）ドレメルツールは、プラスチックチューブのラックからハンドルを切断するために使用されます。長さの0.8センチメートル、高さ0.6センチメートル、幅0.3センチメートル：ハンドルは、以下の寸法で長方形のスペーサーに切断される。 C）プラスチック製スペーサは、等しい間隔でmicroslideチャンバーに取り付けられています。水族館シール剤は、スペーサ（図示せず）との間の隙間に注入される。 D）金属製のバーは、スペーサを介して配置されます。 E）バーとスペーサーは一晩シーラントが乾燥するような場所にすべてを保持するためにバインダークリップをスライド上にクランプされています。 F）スペーサーが削除され、井戸は、それらが防水であることを保証するためにテストされています。 G）終了のスライドは、皿の側面の窓に隣接する金属棒をプラスチックシャーレに収まります。

図3網膜とエレクトロ皿の図。チャンバは、DNA溶液（一度に最大5つの別の解決策）が充填されます。 3つまたは​​4つの網膜は、5室のそれぞれに収まるように、網膜は、レンズが正極に接続された金属の棒にもたれされるように、チャンバーと指向に配置されます。電流は、負に帯電したDNA分子は網膜細胞に移行する原因となります。

図4。flatmountの網膜蛍光レベルの）ImageJの測定。グレースケールflatmount DsRedタンパク質の画像（実験的）とGFP（制御）チャネルは、ImageJのソフトで開かれます。これらのイメージは、説明のみを目的として色付けされていることに注意してください。五測定界は（1〜5）の端とレンズ（点線）を避けて、一様にエレクトロ地域の上に配置されています。 3つの測定円（6〜8）は、バックグラウンド蛍光レベルを決定するために網膜の外側に配置されています。 B）ハイパワーでのエレクトロポレーション網膜片の断面の画像が。外植片は4℃で一晩30パーセントsucrose/1X PBS中で凍結保護生後8日目、° C、OCTに埋め込まれて固定し、12μmで凍結切片した。蛍光灯の構造pNrl（1.1キロバイト）- DsRedをしpNrl（3.2キロバイト）- GFPは、外顆粒層（ONL）における光受容細胞で発現されています。 INL、内顆粒層、GCL、神経節細胞層。

図5 Excelを使用して蛍光データの処理。ステップ1では、各測定のサークルの平均ピクセル値は、スプレッドシート（​​セルB3 - B12、F3 - F5、H3 - H5）にコピーされます。測定は＃1-5は、DsRedの網膜の値で、＃6-8は、DsRedのバックグラウンド値であり、測定は＃9-13 GFP網膜値で、＃14-16に、GFPのバックグラウンドの値です。測定＃2、＃10、などがそうであるように、測定＃1と＃9は、同一の測定円に対応することに注意してください。ステップ2では、DsRedをとGFPのチャネルの平均バックグラウンドの値は、（セルF6、H6）計算されます。ステップ3では、平均的な背景は、すべての網膜の測定（セルC3 - C12）から減算されます。ステップ4では、各バックグラウンドサブトラクションDsRedの測定は、対応するGFPの測定（セルD3 - D7）に正規化されています。