方法論記事

HIV感染患者との経験：末梢血中の細菌叢のシーケンシング

DOI：

10.3791/2830

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2011年6月11日

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1Department of Medicine, Surgery and Dentistry, Clinic of Infectious Diseases, San Paolo Hospital University of Milan, Italy

この記事について

サマリー

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私たちの実験では、HIV陽性患者の末梢血中に転位細菌種のシークエンス解析を実行する方法を説明します。

要約

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健康な消化管は、生理的体液性および細胞性粘膜免疫系の1,2の開発に影響を与える共生微生物の多種多様によって植民地化されている。

微生物叢は、強力な粘膜関門を介した免疫系から遮蔽されている。感染症と抗生物質は、通常の消化管の障壁と3つの可能な免疫異常につながることが常駐細菌の構成、両方を変更することが知られています。

HIVは、全身免疫活性化4-7を貢献する、リポ多糖と細菌のDNA断片のような細菌のバイオ製品、、の全身循環への粘膜免疫と漏れの進行性破壊と消化管バリアの侵害を引き起こします。微生物の転座は、HIV /エイズ免疫病原性と治療4,8への応答に関与している。

我々は、HIV感染患者の末梢血中に転位細菌の組成を特徴づけることを目的とした。私たちの目的を追求するために我々は、シークエンス解析に続いてpanbacteric 16S ribosomial遺伝子のPCR反応をセットアップします。

簡単に言えば、両方のHIV感染と健常人全血が使用されます。健常者が正常な腸内恒常性を提示することを考えるとフローラのは転座は、これらの患者に期待されていません。静脈穿刺および血漿分離によって全血採取に続いて、DNAは血漿から抽出し、panbacteric 16S ribosomial遺伝子9用の幅広い範囲のPCR反応を実行するために使用されます。以下のPCR産物の精製、クローニングとシークエンシング解析を実施しています。

プロトコル

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HIVに感染した血液サンプルの取り扱いが重要な推奨事項が必要です。
血液のすべての標本は、堅牢な漏れ防止のコンテナで輸送する必要があります。コンテナの外装のと試料に付随する事務処理の汚染を避けるために標本を収集する際には注意が必要です。
感染した血液を処理するすべての者は、手袋を着用する必要があります。手袋が変更され、手は、検体処理の完了後に洗浄する必要があります。
HIV感染血液サンプルの処理は、クラスIIバイオハザードキャビネットのフードで行う必要があります。
機械式ピペットエイドを使用する必要があります。
針や他の鋭利（ガラスなどのピペットやキャピラリーチューブを含む）の使用は選択肢が存在しない状況に限定されている必要があります。
実験室の表面は血の流出後の適切な化学消毒剤で除染する必要があり、作業活動が完了しているとき。
使用される汚染された材料は再使用前に除染する必要がありますまたは臨床廃棄物の経路を経由して正しく廃棄する必要があります。
介入が効果的であることが速やかに開始しなければならないとして、潜在的に感染血液や体液（すなわち、それらの必要とする普遍的予防策）への職業ばく露のすべての事件は、医療上の緊急事態として扱う必要があります。
プロトコルは、その完成のための5日間が必要です。時間枠は、図1に詳述されています。
細菌種は、図2で説明した方法を用いて識別されます。

1。サンプル....

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ディスカッション

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我々はここにHIV感染者の末梢血中の細菌の転座を特徴づけるためにPCR /シーケンシングプロトコールを示す。

最も信頼性の高い結果が得られる。採血後、血漿が溶血し、DNA断片の劣化を避けるために、2 / 3時間以内に遠心分離によって分離されるべきである。サンプルは-80℃で、約5日間と℃、-20℃で最初に格納されています細菌DNAの損失を引き起こす可能性のある複数の凍結と融解を繰り返すことは避けて下さい。

血漿サンプルを融解後、12時間以内に使用する必要があります。

最適化は、ドナーの末梢血からのDNAの最大量を得るために実施した。後者はまた、末梢血細胞由来のDNAの偉大な量で、表される細菌DNAの少量が含まれているため、より具体的には、プラズマの代わりに、全血は、使用されています。

我々は意図的.......

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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我々は、ビデオの製作と優秀な支援のためのジャンニシモーネに感謝しています。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前会社カタログ番号コメント（省略可能）
イースティ- DNAキットインビトロジェン K 180001
クロロホルムシグマアルドリッチ C2432
エタノールシグマアルドリッチ E7203
超高純度Waer インビトロジェン 10977049
リゾチームフルカ 62970 蒸留水で10μg/ mLの
のAmpliTaqゴールドアプライドバイオシステム 26478701
マイクロコントローラ100 ミリポア 42413
PCRプライマーインビトロジェン
アガロースエッペンドルフ C1343
DNAラダーインビトロジェン 15628019
Purelink PCRマイクロキットインビトロジェン K310050
LB寒天、粉インビトロジェン 22700025
Bactoagar インビトロジェン
アンピシリンインビトロジェン 11593027 蒸留水に10 mg / mLの
X - galをインビトロジェン 15520034 DMFで40mg/mL
IPTG インビトロジェン 15529019 蒸留水に100mMの
TOPO TAクローニングキットインビトロジェン K450002
Purelinkクイックプラスミドミニプレップキットインビトロジェン K210010
ビッグ染料アプライドバイオシステム 4337455
DyeEx 2.0スピンキットキアゲン 63204

参考文献

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  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
  2. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Na....

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