ゲインまたは機能研究の損失のいずれかを実行する目的のためのマウス網膜細胞へのプラスミドDNAの取り込みのための方法 in vivoで提示されます。このメソッドは、外部電場の印加によって誘導される細胞の細胞膜の透過性の一過性増加を利用しています。
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この記事について
サマリー
要約
哺乳類の網膜の開発の過程で発現する遺伝子の機能解析は重要な課題である。関数のノックアウトの構成的または条件付き損失を生成するためにジーンターゲッティングは、コストや手間が、同様に時間のかかる作業のまま。これらの課題に加えて、網膜はノックアウトのアプローチを使用するときに遺伝子が意図しない困惑さにつながる網膜の外側に不可欠な役割を持っていることが表明した。細胞の運命の仕様および/または分化における役割を同定しようとすると、さらに、異所的機能の実験の利得の遺伝子を発現する能力は非常に価値があります。
我々は、エレクトロポレーションにより新生児マウスの網膜へのDNAプラスミドの迅速かつ効率的な組み込みのための方法を提示する。膜1,2,3,4にわたって材料の移転を促進する細胞膜透過性の一過性増加に一定の電界強度の結果、上記の短い電気インパルスのアプリケーション。画期的な作品は、エレクトロポレーションは、脂質二重膜5を介して高度に荷電したDNAの通過を可能にする親水性の原形質膜の細孔の形成を誘導することにより、哺乳動物細胞への遺伝子導入の方法として利用され得ることを実証した。継続的な技術開発は、網膜、ここ6、7、8、9、10に記載されているメソッドを含む複数のマウス組織におけるin vivoでの遺伝子導入のための方法として、エレクトロポレーションの実行可能性をもたらした。
そのDNAが新生児（P0）のマウス及び電気パルスの網膜色素上皮と網膜の間に配置されるようにDNA溶液をピンセット電極を使用して適用される網膜下腔に注入される。マウスの眼の横方向の配置が必要な負極- DNA -網膜-正極配置にピンセット電極を容易に方向することができます。挿入遺伝子の大規模な組み込みと発現は生後2日目（P2）によって識別できます。網膜の細胞の重要な側方移動の不足のため、エレクトロポレーションおよび非エレクトロポレーション領域が生成されます。非エレクトロ地域はどこに適切な内部組織学的コントロールとして機能することができる。
網膜エレクトロポレーションは、CAGのように、ユビキタスプロモーター下に遺伝子を発現する、またはshRNAコンストラクトまたはクレアンリコンビナーゼを用いて遺伝子機能を破壊するために使用することができます。よりターゲットを絞った発現は細胞特異的遺伝子のプロモーターと構造を設計することにより達成することができます。エレクトロポレーションした細胞の可視化は、GFPを発現したり、GFPの発現構築物の共同electroporatingでバイシストロン構文を使用して実現されます。さらに、複数の構成要素は、コンビナトリアル遺伝子の効果や異なる遺伝子の機能の同時利得と損失の研究のためにエレクトロポレートされることがあります。網膜エレクトロポレーションは、適切な発現コンストラクトおよび欠失変異体を生成することで、ゲノムのシス調節エレメントの解析に利用することができる。このような実験は、細胞特異的遺伝子発現11の十分なまたは必要なシス調節領域を同定するために使用することができます。潜在的な実験は、構造可用性によって制限されます。
プロトコル
1。エレクトロポレーションのためのプラスミド調製
エレクトロポレーションに必要なDNAの濃度は5μg/μlです。これは典型的には、所望のプラスミドは、作業量のDNAの精製と濃縮しマキシプレップ（キアゲン社）またはそれと同等のメソッドを使用して増幅する必要があります。次の手順は、作業量のDNAの調製を記載する。
- 注し100はDNAのμgの（マキシプレップまたは同等の）と操作の容易さのために100μLにボリュームを希釈する。
- フェノール追加、フェノールの量は約60％のDNA /体積比（μgのDNA：総容積）を得るために計算する必要がありますすなわち：100μgのDNA（100μLで）プラス67μLフェノール（100μgの：167μLを）。充分に混和、これはDNAの過剰なせん断が発生する可能性があるため、上下にピペッティングしていません。
- 室温で14000rpmで5分間、DNAを回転させる。
- 上清を収集し、同じDNAを用いてクロロホルムに追加：ステップ1.2の総体積比、ミックスなど、室温で5分間、14000rpmでステップ1.2とスピンで説明を。
- DNA溶液の3 M酢酸ナトリウムの10％上清ボリュームを追加し、上清を収集し、穏やかに混合し、2.5 X 100％エタノールの上清ボリュームを追加します。転倒混和します。 DNAは、ミキシングの際に溶液から沈殿してください。
- ....
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ディスカッション
in vivoでエレクトロポレーションは、DNAの発現プラスミドと網膜細胞の形質転換のための迅速かつ効率的な方法を表します。このメソッドは、実験者が異所的に普遍的に発現プロモーターの制御下に目的の遺伝子を導入することにより、機能研究のゲインを実行したり、関心のある遺伝子を標的とするshRNAコンストラクトを使用して、関数の研究の損失を実行することができます。さらに、複数のDNAプラスミドは、実験者は、複数の遺伝子の効果を分析したり、関心の第二の遺伝子を導入しながら、一つの遺伝子をノックダウンすることができます、同時に電気穿孔することができます。 Creリコンビナーゼの発現を駆動するプラスミドのエレクトロポレーションは、また関心のfloxed遺伝子を含む動物が利用可能なモザイクの方法で遺伝子発現を排除するために利用することができます。このメソッドは、本質的な対外因性遺伝子機能の決定のために特に有用です。逆にバック従来のノックアウトマウスの網膜への遺伝子のエレクトロポレーションは、実験者はノックアウトで識別される表現型を逆転しようとする救助の研究を行うことができます。どんなバックグラウンド株のマウスは、実行される試験の要.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、NIH R01EY020560 - 01でと医学研究賞のWMケックヤングの学者によって賄われていた。著者らは、網膜の調製と注射の撮影中に彼の援助のためにジョセフBedontに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| バッファが飽和フェノール | インビトロジェン | 15513-039 | N / |
| クロロホルム | JTベイカー | 9180〜03 | N / |
| 酢酸ナトリウム | JTベイカー | 3470〜05 | 3 Mの株式 |
| ファストグリーンFCF | フィッシャーバイオテック | BP123 - 10 | 10％の株式 |
| イソプロピルアルコール準備 | タイコヘルスケア | 6918 | N / |
| 30 guage針 | テルモメディカル社 | SG2 - 3013 | N / |
| Exmireマイクロシリンジ | 株式会社イトー | MS * E05 | N / |
| Tweezertrode（ピンセット電極） | BTXインストゥルメント、Genetronics株式会社 | 522 | N / |
| 電気スクエアPorator（エレクトロ） | BTXインストゥルメント、Genetronics株式会社 | ECM 830 | N / |
| OCTコンパウンド | サクラファインテック米国 | 4583 | N / |
参考文献
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability....
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再版と許可
