環境bacterioplanktonは、有機炭素（DOC）化合物とDNA標識試薬、ブロモデオキシウリジン（BrdU）を溶解モデルとインキュベートされています。その後、DOC分解細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）を使用して自身の昇格BrdUの取り込みに基づいてバルクコミュニティから分離されています。これらの細胞は、その後の分子生物学的解析によって識別されます。
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方法論記事
ブロモデオキシウリジン（BrdU）標識と溶存有機の文化に依存しない識別に対する後続の蛍光活性化細胞選別カーボン分解Bacterioplankton
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
微生物は、水生環境における多数の溶存有機炭素（DOC）基質の分解を仲介する主要なエージェントです。しかし、自然の中でDOCの特定のプールに変換細菌の分類群の同定には、技術的な課題となっています。
ここでは、アプローチを説明しているカップルのブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込み、蛍光活性化細胞選別（FACS）、および16S水生環境において分解する特定のDOCの化合物の能力bacterioplanktonのカルチャに依存しない識別を可能にするrRNA遺伝子に基づく分子解析。三連のbacterioplanktonの小宇宙を、BrdUとモデルのDOCの化合物（DOC修正）、または唯一のBrdU（無添加制御）の両方を受け取るよう設定されております。 BrdUの代替は、新たに合成された細菌DNAおよびBrdU標識DNAのチミジンの位置は容易に免疫検出1,2できます。 24時間のインキュベーションを通じて、付加価値DOCの化合物を使用することができるbacterioplanktonが選択的に活性化し、それゆえにDOCの改正と細胞に非応答性細胞よりBrdU取り込み（HI細胞）のレベルが高いことが期待されているは、さらにコントロール（低BrdU取り込み細胞、LI細胞）。蛍光免疫検出した後、HIの細胞が区別され、物理的に蛍光活性化細胞選別（FACS）3でLI細胞から分離。ソートされたDOC -応答性細胞は（HI細胞）のDNAを抽出し、分類学的PCR、クローンのライブラリー構築と塩基配列決定を含め、その後の16S rRNA遺伝子ベースの解析によって識別されます。
プロトコル
1。水のサンプルの処理
- 大きな粒子とbacteriovoresを削除するには、1μmの孔径のメンブレンフィルターを通してフィルター10L環境水。カーボイの水ろ液を集める。
- 4ミリリットル、新たに調製したパラホルムアルデヒド溶液（、10％PFA）を含む3滅菌エッペンドルフチューブ（50ml）に移転36ミリリットルろ液それぞれ。細胞を維持するために、室温で2時間インキュベートする。真空濾過によって0.22μmの孔サイズの白いメンブレンフィルター上に細胞を集めます。真空濾過によってフィルターを介して生理食塩水（PBS）をリン酸緩衝10 mlを渡すことでフィルタを洗浄してください。ネガティブコントロールとしてフィルタにラベルを付けて、-20℃で保管します
ステップ1.3から1.4には、DOC -限られた条件を確立するためのオプションです。
- カーボイに無機態窒素とリン（5μMのNH 4 Clを、5μMのNaNO 3を 、及び1μMのNaH 2 PO 4、最終濃度）の混合物を追加。
- 時折扇動で48時間その場の温度で、暗所でインキュベートする。
2。縮図の設立とインキュベーション
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ディスカッション
水生環境での個々のDOC成分を代謝するbacterioplanktonの種レベルの識別を可能にするために我々のアプローチのカップルBrdUの取り込み、FACSおよび16S rDNAの解析。のみ活性細菌の解析を可能にするため、休眠細胞が含まれていない代謝活動に基づいて、BrdU取り込みアッセイラベル細菌細胞、。我々のアプローチでは、BrdUの取り込みは、その後に可視化するBrdUの取り込みのレベルが異なる免疫検出現場や細菌にグループ化し、FACSを用いてソートされます。 BrdUの法人の細胞の分析はまた、分子解析2,8,9に続いてBrdU標識DNAの磁気ビーズimmunocaptureを使用して報告されている。後者の方法論の一つの制限は、別の活動レベルの細胞を区別することができない点です。その場合には、分析には、水試料（図1、LIS）の先住民族DOCを使用することによってのみ、わずかにアクティブな状態の細胞が含まれます。
結合アプローチは、ジメチルスルホニオプロピオン酸（DMSP）、バニリン、沿岸海水中のグリシンベタイン<.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
このプロジェクトの資金は、国立科学財団助成金OCE1029607（XMまで）とMCB0702125（MAMへ）とゴードンとベティムーア財団（MAMへ）によって提供されていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| の名前 | タイプ | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| BrdUを | 試薬 | シグマ | B5002 - 5G | |
| リゾチーム | 試薬 | シグマ | L6876 - 5G | |
| プロテイナーゼK | 試薬 | シグマ | P2308 - 25mgを | |
| In Situ細胞増殖キット、FLUOSで | キット | ロッシュ | 11810740001 | 抗BrdU - FLUOSと製造元が推奨する速度よりも反応あたりのインキュベーションバッファーをより多く消費する。 |
| フレームシールのインキュベーションチャンバー | 材料 | Bio - Rad社 | SLF - 1201 | |
| ポリカーボネート膜フィルター（142 - MM -直径、1.0μmの孔径） | 材料 | ミリポア | FALP14250 | |
| ポリカーボネート製メンブレンフィルター（25mmの直径、0.2μmの孔径） | 材料 | ミリポア | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaqのReady - To - GoのPCRビーズ | キット | GEヘルスケア | 27-9559-01 | |
| QIAquickゲル抽出キット | キット | QIAGEN | 28704 | |
| FailSafeはPCRシステム | キット | EPICENTRE | FS99060 |
参考文献
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J.
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再版と許可
