三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

Summary

このレポートでは、我々は三次元皮膚がアーキテクチャと構成に人間の皮膚を模倣したモデルを再構築について説明します。メラノサイト生理学、メラノーマ進行や皮膚幹細胞の運命は、皮膚、モデルの再構築を使用して検討されている。モデルはまた、薬剤の評価のための前臨床ツールとして有用である。

Abstract

累積証拠は、その細胞は、それらが3次元細胞外マトリックス内で栽培されている時に異なった動作をしても、他のセル（1-5）と相互作用を示唆しながら、実験的な皮膚の生物学のin vitro試験でほとんどは、2次元（2D）モノカルチャーで行われている。マウスモデルは、広く生体内の組織の形態形成を研究するために利用されている。しかし、マウスとヒトの皮膚は、それが困難なヒトへのマウスの研究を推定するために行う細胞構造と生理機能に大きな違いを、持っている。マウスの皮膚のメラノサイトが主に毛包にローカライズされているので、それらは主に表皮の基底層で見つけている人間のもの、とは異なる生物学的性質を持っている。 3Dヒト皮膚再構築モデルの最近の開発は、異なる種類の細胞の間で細胞 - マトリックスと細胞間相互作用を調査するフィールドを有効にしています。コラーゲンIマトリックス、層化、差別化されたケラチノサイトおよび真皮から表皮を分離する機能的な基底膜、から構成されている"表皮"、に埋め込まれている線維芽細胞と"真皮"で構成されて再構築。コラーゲンは、足場、栄養配信、および細胞間相互作用の可能性を提供します。メラニン細胞がメラ​​ニン細胞恒常性と人間の皮膚のメラノーマ進行の自然の特徴を再現組み込んだ3次元皮膚モデル。 in vivoで同様に、再構成された皮膚のメラノサイトは、基底層のケラチノサイトが散在基底膜に局在している。メラノーマ細胞は、in vivoで 、元の腫瘍の病期（RGP、VGPおよび転移性メラノーマ細胞）を反映して、同じ特性を示す。最近、皮膚幹細胞は、ヒトの真皮（6）において同定されている。これらのマルチ強力な幹細胞は、表皮に移行し、メラノサイトに分化することができます。

Protocol

1。三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：

1. 無細胞層の調製：0.59 mLの10X EMEM、50μlの200mmのL -グルタミン、0.6 mLのFBS、120μlの7.5％の重炭酸ナトリウムおよび4.6 mLのウシコラーゲンIの1 mLを追加：氷上で50 mLのチューブに以下の試薬を混合組織培養トレーの各インサートに混合。室温で30分間インキュベートし、ゲルが固化することができます。混合物の色は淡黄色からピンクにしてください。
2. DMEMを中和するために10％FBSを含む追加、0.25％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒト線維芽細胞をトリプシン処理。 10％FBSを1.5 mLのDMEMで遠心分離し、再懸0.45 × 10 ^6個の細胞で細胞を回収。皮膚幹細胞の場合は、遠心分離、球を分離するためにフラスコをタップすることで、6600皮膚の球を（皮膚の幹細胞は幹細胞の培地で生育したとき、彼らはニューロスフェアと同様の方法で球を形成する）を収集。
3. 細胞層の調製：氷の上を50mLチューブに次のようにミックス：1.65 mLの10X EMEM、150μlの200mMのL -グルタミン、1.85 mLのFBS、350μlの7.5％の重炭酸ナトリウム、14mlのウシコラーゲンIおよび1.5 mLの線維芽細胞の懸濁液ステップ2（代 ​​わりに、皮膚幹細胞再構築のために私培地を再構成皮膚の1.5mLの、0.45 × 10 ⁶線維芽細胞および6600真皮球の組み合わせを使用する）から、よく混ぜる。それぞれの無細胞層でコーティングされたインサートの混合液を3 mLを加え。 37℃で5％CO ₂組織培養インキュベーターで45分間インキュベートする。混合物の色はピンクに黄色の麦わらからする必要があります。ゲルが固化した後、DMEM 10％FBSを（2mLの内側と皮膚の再構築トレイの各ウェルに挿入10mLの外）を含む追加。 4日間インキュベートし、ゲルの契約のことを確認してください。
4. 各インサートの内側と外側の両方から培地を吸引除去する。定期的に血清を洗い落とすために、内側とインサートの外側に10mLに培地（1％透析FBSとHBSS）を2mLの洗浄に追加します。 37℃で1時間インキュベート℃に
5. 皮膚の準備は、メディアを再構築：
   1. 正常メラノサイトと皮膚幹細胞のために再構築：基本培地（500 mL）を作成するには、以下の試薬を混合：490 mLのケラチノサイト無血清培地、1.8 mLのウシ下垂体抽出物、10 mLの透析ウシ胎児血清、10μgの/ 500μLをmLのSCF、4μg/ mLのbFGFおよび264μg/ mLのET - 3の500μlの562.5μL。培地I：100mLの基本培地に100μg/ mlの10μlのEGFを追加する。培地II：100mLの基本培地に2μlのEGFを追加する。培地III：300mlの基本培地に1 Mの720μlのCaCl _2を追加。
   2. 黒色腫の皮膚のために再構築：中I（100mLの）は、以下の試薬を混ぜるようにするには：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、200の200μlのヒドロコルチゾン500XμlのITES、200μlの0.05のO - phosphorylethanolamine M、90 mMの、2 nmの200μlのプロゲステロン、1 M 240μLのCaCl _2、10 nMの200μlのトリヨードチロニンとchelexed新生児ウシ血清100μlを200μlのアデニン（、血清100mLにChelex 100の3gを溶解し4℃で1.5時間℃で、フィルター滅菌をかき混ぜる）。ミディアムII（100mLの）を作るために、以下の試薬を混ぜる：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、500Xの200μlのITES200μlのヒドロコルチゾン、 1 M、10 nMの200μlのトリヨードチロニンと100μlの新生児ウシ血清の200μlの0.05のO - phosphorylethanolamine M、90 mMの200μlのアデニン、2 nmの200μlのプロゲステロン、240μlの塩化カルシウム。ミディアムIII（300ML）を作るために、以下の試薬を混合：DMEMの142.5 mLの、F12の142.5 mLの（HAMの）、200mMのL -グルタミンの6 mLを、269 g / mlで、500Xの600μlのITESの600μlのヒドロコルチゾン、0.05の600μlのO - phosphorylethanolamine M、90 mMの600μlのアデニン、2 nmの600μlのプロゲステロン、1の720μLのCaCl _2、M、10nmと6 mLの新生児ウシ血清の600μlのトリヨードチロニン。
6. 大豆トリプシンインヒビター（1Xリン酸塩の250 mg / Lの緩衝生理食塩水）でトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトケラチノサイトをトリプシン処理、培地を再構成皮膚の4.17 × 10 ⁶細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウンI.
7. 培地I.を再建皮膚0.83 × 10 ⁶細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウン、大豆トリプシンインヒビターとトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトメラニン細胞または黒色腫細胞をトリプシン処理
8. 各インサートの内側と外側の両方から培地を洗濯取り外します。
9. 皮膚が培地I（各インサートの外側に内側と10 mLの1.5 mL）を再追加。
10. 、ケラチノサイトとメラノサイトまたはメラノーマ細胞の600μlの細胞懸濁液の600μlの細胞懸濁液を取るよく混ぜる。各インサートの内側にドロップして200μlの混合細胞懸濁液のドロップを分注する。皮膚幹細胞の場合は、再構成するケラチノサイト懸濁液100μlをのみ使用します。 37℃で2日間インキュベート℃に
11. 私培地を再構築皮膚を吸引除去する内側と各インサートの外側の両方から。培地IIに（内側から2 mLおよび外側に10 mL）を再構成皮膚を追加。 37℃でさらに2日間インキュベート℃に
12. 吸引皮膚は内側から培地IIを再構成し、各インサートの外側には、7.5mlのスキンは外側だけに培地IIIを再追加。この点から、表面が空気にさらされている開始再構成する。 18日目まで一日おきに培地IIIを変更します。
13. 収穫の皮膚は、一日18で再構築：
    1. 内側とインサートの外側から培地を吸引除去する。
    2. ピンセットでトレイからインサートを取り外します。
    3. 手術用メスの刃で端に円形の近くにトレースすることで（ポリカーボネートフィルターを含む）の再構築を切り取ります。
    4. ハード面で再構築し、半分にフィルターをカット。
14. パラフィン切片の場合：2黒TBS生検の論文との間の組織学のカセットに再構築し、4時間以上10％ホルマリンで全体のカセットを浸漬の半分を置きます。その後70％エタノールでカセットを配置し、それを4℃で保存して、パラフィン包埋のために再処理するための準備が整うまで。
15. 凍結切片の場合：
    1. の他の半分を置きます4で50％のショ糖で再構築° Cを1〜2時間、その後2Mにショ糖を変更し、別の1〜2時間4℃に保存。
    2. それは船の約50％を埋めるように使い捨てのベース金型に最適な加工温度の凍結媒体（OCT）を分注する。 OCTのいずれかの泡を避けてください。
    3. 鉗子で再構築し、スクロースから再構築削除のエッジをつかむ。キムワイプはショ糖を吸収するまでキムワイプの上に置きます。
    4. 鉗子やヘラを使用して、OCTの上にベースの金型に再構築を移す。ベースの金型が完全にいっぱいになるまで多くのOCTで再構築の上部をカバーしています。あなたが困難にカットできるようになりますOCTでいかなる気泡がないことを確認してください。
    5. 砕いたドライアイス上で均等に基本型を置き、そして、OCTは完全に凍結することができます。
    6. スズ箔で基本型をラップし、それを-70℃で保存するクライオスタットでそれを切る準備が整うまで。
16. 移植皮膚は、マウスで再構築：
    1. DMEMの5mLの（凍結と解凍のマウスの皮膚用）と50 mLのファルコンチューブを準備します。
    2. 6週間前後雌SCIDへアレス非近交系マウスを使用してください。
    3. マウスは、イソフルランで麻酔です（EZ麻酔システム）：最初の麻酔は、イソフルラン4％（マウスが手術台に移動される前）で誘導チャンバ内で行われ、手続き時にノーズコーンブリーザーによって麻酔を維持している（イソフルラン：1.5〜2パーセント）。低体温麻酔時の眼の怪我を防ぐために適用される無菌眼科用潤滑油を防止するために、加熱パッドにより熱のサポート。
    4. ビーカーに600mlの水を入れ、40との間に水の温度を保つためにホットプレートの上に残す - 60℃
    5. 複合ベンゾインチンキとアルコールの準備を綿棒でマウスの皮膚をきれいにします。
    6. 後で縫合のために同じ位置を維持するために、マウスの背中の上に行をマーク。
    7. アイリスのハサミとピンセットを用いて、マウス上部の背面に直径1.2 cm程度の円形創傷床をカット。滅菌ガーゼのスポンジを創傷床をカバーしています。 DMEM 5mLに丸いマウスの皮膚を置く、それは完全に凍結するまで液体窒素の容器のまま。霜取りは、ホットプレートの上にお湯の管が完全に融解するまで。 3回繰り返します。
    8. 皮膚のトランスウェルを使用して外科ブレードから再構築し、非常に慎重に膜を除去デタッチ、創傷床の上に（上表皮側）を再構築皮膚を転送する。
    9. 皮膚の再構築の上にマウスの皮膚（上表皮側）を配置します。
    10. マウスの皮膚を修正するためにして、以前にラベルを付けたマーカーの最初の縫合、底部の2番目、両側にある2個以上の縫合を行う。
    11. 移植後のクリーンマウスの皮膚。ノーズコーンを外し、目を覚まし、外来まで加熱パッド上でマウスを保持します。
    12. 新しいケージにマウスを置く。
    13. 手術直後は皮下注射、手術後24時間および48時間でメロキシカム（1 mg / kg体重）：手術鎮痛を投稿。

2。代表的な結果：

皮膚は、正常メラノサイトと皮膚幹細胞で再構築
皮膚は、インサート付き特別6穴トレイで培養され再構築されます。皮膚コンパートメントは、最初の4日間（図1A）のために10％FBSを含むDMEM中で培養される。皮膚は、角化細胞がメラ​​ノサイトまたはメラノーマ細胞（図1B）を播種しているときに私が使用されている培地再構築。表皮は、9日目で空気にさらされると、これは角化細胞が分化することができます（図1C）されています。 18日目で、皮膚の表皮は、階層化ケラチノサイトの層で構成されて再構築。未分化基底層と連続して差別化された層は、（図1D）に縦に並んでいます。染色メラノサイトのマーカーS100で再構築のセクションを覆うとそのメラノサイトがデンドライト拡張機能を介して複数のケラチノサイトと表皮と通信の基底層（図1E）に整列されて表示されます。皮膚コンパートメントは、I型コラーゲンマトリックスに埋め込まれている線維芽細胞が含まれています。堆積コラーゲンIVは、真皮（図1F）から表皮を分離する基底膜を、示している。皮膚幹細胞（GFPレンチウイルスベクターで標識）コラーゲンIマトリックスの線維芽細胞に埋め込まれている場合、それらは表皮に移行し、メラノサイト（1）、（図2）に分化する。表皮のケラチノサイトの複数の層が開発されています。

皮膚は黒色腫の腫瘍の再構築
一般的な買収母斑、異形成母斑、RGP（放射状増殖相）メラノーマ、VGP（垂直増殖期）黒色腫と転移性黒色腫（7）：臨床病理学的研究は、段階的にその黒色腫の進行状況を示します。メラノーマ細胞株の異なる段階では、2次元文化の中でお互いに形態学的に似ています（図3A - D）が、それらが皮膚再構築に組み込まれているときに、細胞の挙動は、彼らの中のin vivoでの特性を反映している。場所と正常メラノサイトの成長率は、しっかりと皮膚の再構築（図3E）で制御されます。 VGPメラノーマWM793は真皮（図3G）に侵襲的に成長するのに対し、RGP主メラノーマWM35は、表皮（図3F）で主に増殖する。転移性黒色腫1205Luは積極的に真皮（図3H）の奥深くまで侵入する。

図1。皮膚は、正常メラノサイトで再構築する。皮膚の肉眼的形態は、ACに示されている再構築する。コラーゲンと混合A.の線維芽細胞を10％FBSおよびフォーム皮膚コンパートメントを含むDMEM中で増殖されています。 B.のケラチノサイトとメラノサイトが真皮の上に播種し、培地を再構築皮膚に成長されています。 C.表皮は、9日目で空気にさらされている。 D. H＆E染色皮膚再構築は、垂直に構成される表皮、指向基底層、および順次分化した層化細胞層を示す。真皮は、コラーゲンI型マトリックス中に埋め込まれた線維芽細胞が含まれています。 E. S100陽性メラノサイト（黒矢印）は、複数のケラチノサイトと基底膜との通信で整列される。 F.コラーゲンIV -染色では、真皮から表皮を分離する基底膜を、示している。 DFのすべてstainingsは、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片で行った。

図2。皮膚の真皮幹細胞は、表皮に移行し、メラノサイトに分化再構築します。5日目に播種ケラチノサイトの後、単一のGFP陽性細胞（緑）が球からの移行を開始。表皮は、まだ単層で構成されています。 8日目では、少数の細胞は表皮 - 真皮のインタフェースに到達する。 10日目では、GFP陽性細胞がしっかりと基底膜の位置に配置されます。移行したGFP陽性表皮エクスプレスメラノサイトのマーカーHMB45の細胞（赤、のような白い矢印で示す）。核はDAPI（青）で染色されています。表皮は、複数の層として開発されています。基底膜は白い点線で示されます。

図3。皮膚は黒色腫のさまざまな段階の再構築：AD。正常メラノサイトおよびメラノーマ細胞は、2次元培養液内で成長する。包皮からAはメラノサイト。 B. RGP WM35細胞。 C. VGP WM793細胞。 D.転移性メラノーマ1205Lu細胞。 E.正常メラノサイトは、基底膜に位置しています。 F. RGPメラノーマWM35細胞は表皮の細胞のクラスターとして成長する。 G. VGPメラノーマWM793細胞が基底膜を介して真皮に侵入。 H.転移性黒色腫1205Lu細胞が積極的に真皮に深く侵入する。

トラブルシューティング

問題が	トラブルシューティング
コラーゲンの混合物は固化していない	コラーゲンの混合物の色がピンクに藁の黄色でなければならない、そうでなければpHが間違っているとコラーゲンゲルではない場合があります。色は明るい黄色である場合は、より多くの重炭酸ナトリウムは、滴ずつ追加する必要があります。
コラーゲンは、途中でmixutureに析出	コラーゲンの混合物をインサートの上に配置されるまで氷の上ですべてのコンポーネントを置かないでください
契約コラーゲンは（片側が反対側よりも厚くなる）にもない	インキュベーターの棚のキャリブレーション
表皮は、つ以下ケラチノサイトの層が形成されている。	下の通路で未分化ケラチノサイトを使用してください

Discussion

我々は3次元皮膚の生成で説明している正常ヒトメラノサイト、皮膚幹細胞およびメラノーマ細胞で再構築。単層培養で増殖させた場合、メラニン細胞は、同様の形態（扁平、スピンドルまたは樹枝状の形をした多くの）に関係なく、臨床病期の彼らの起源を紹介。対照的に、3Dの皮膚は、メラノーマ細胞の段階に固有のプロパティを再現再構築します。正常ヒトメラノサイトは、単一の細胞として表皮と真皮層の間の基底膜に存在。より積極的なVGPのメラノーマ細胞は、真皮に基底膜を突破する大規模なクラスタとして成長するのに対し、RGP原発性黒色腫細胞は基底膜に沿って小さなクラスターとして成長する。転移性悪性黒色腫細胞はすべての方向に成長し、単一細胞やクラスタなどの真皮の奥深くまで侵入する。定量分析は、侵入の深さと増殖の程度を測定することにより、このモデル上で行うことができます。正常および悪性メラニン細胞の特性に加えて、我々が直接表皮の基底層にどの家庭、成熟したメラノサイトに皮膚幹細胞の分化を誘導し、E -カドヘリンのアップレギュレーションによってケラチノサイトとの善意の通信を確立できるモデルを用いて（ 6）。

ウイルスベクターを用いて、我々は、アクティブまたはメラノサイトの変換のメカニズムだけではないを研究するために効率的なモデルであることを約束するダイナミクスと皮膚内の各セルの種類によって発現する遺伝子の機能的意義の理解を深める再構築、のために遺伝子機能を不活性化することができますだけでなく、黒色腫（8）の進行。細胞の表現型の長期観測は、皮膚の移植によって免疫不全動物に再構成することが可能となった。このような人間の皮膚 - マウスキメラはmelanomagenesisと黒色腫の転移を研究するために優秀な研究ツールです。

皮膚はまた、薬剤の評価に有用なプラットフォームになることができます再構築します。 2次元培養条件でがん細胞を根絶する多くの薬は、しばしば実験的および臨床応用にはほとんど影響がありません。 in vivoでの腫瘍内に見られるように、3次元培養で黒色腫細胞は多くの場合に応答する細胞2D文化の薬剤に対して耐性である、微小環境は、黒色腫でシグナル伝達経路を調節することを示唆している。成功した創薬のために、3Dの皮膚は、モデルを再構築する生体内で化合物（9,10）の効果を予測するために理想的な臨床ツールです。

要約すると、皮膚はモデルがin vitroおよびin vivo試験との間のギャップを埋める再構築。彼らは、遺伝子が形質転換に関与しているのより良い理解につながるとどのように幹細胞がその変革に貢献する。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
10倍EMEM	バイオウィテカー	12 - 684F
L -グルタミン	ギブコ	25030-081
ウシ胎仔血清	Hyclone	SH - 30071.02
ウシ腱酸抽出コラーゲン	器官形成	50分の200
組織培養6ウェルインサート付きトレー	器官形成	9285
ケラチノサイト無血清培地	ギブコ	17005042
透析ウシ胎児血清	Hyclone	SH - 30079.03
組換えヒト幹細胞因子	フィッツジェラルドインダストリーズ	RDI - 307 - 255X
塩基性FGF	フィッツジェラルドインダストリーズ	30R - AF015
エンドセリン-3、人間の	アメリカンペプチド（株）	88-5-10
塩化カルシウム	シグマ	C - 7902
DMEM	JRHバイオサイエンス	56430 - 10L
F12（HAMの）	ギブコ	11765〜54
ヒドロコルチゾン	シグマ	H - 0888
インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレン（ITES）	BioWhittaker	17839Z
O - Phosphorylethanolamine	シグマ	P0503
アデニン	シグマ	A9795
プロゲステロン	シグマ	P - 8783
トリヨードサイロニン	シグマ	T - 5516
新生児ウシ血清	Hyclone	SH3011802
10％ホルマリン緩衝液	Surgipath	00600
最適な切削温度の凍結媒体（OCT）	桜	4583
マルチカセット	Surgipath	02293 - BX
TBS生検の論文	トライアングル医歯薬学総合研究	BP - B
TBS生検の論文	トライアングル医歯薬学総合研究	BP - B
使い捨てのベース金型	フィッシャー	15から182 - 501C
複合ベンゾインチンキ	プロの使い捨て、株式会社、	S42450
アルコールプレップ綿棒	CVS薬局
シルクブラック編組5から0	エチコン	682G
ガーゼのスポンジ（無菌）	CVS薬局
鉗子	Roboz	RS5070
アイリスはさみ	Roboz	RS5913
外科ブレード	フェザー	2976
EZ麻酔	Euthanex株式会社
SCIDへアレス非近交系マウス	チャールズ川