方法論記事

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

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DOI：

10.3791/2965

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2011年7月18日

 , 
1Division of Cell Biology and Genetics, House Ear Institute

この記事について

サマリー

electromotility、遅い運動性と曲げを含む外有毛細胞（OHC）運動性応答を、調査するために信頼性の高い方法が記載されている。 OHCの運動性は、外部の交流電界と刺激によって誘発される、との方法は、高速画像記録、LEDベースの照明、そして最後の世代の画像解析ソフトウェアを活用しています。

要約

OHCSはコルチ器、哺乳類の内耳内の聴覚器官のオルガンにある円筒状の感覚細胞である。名前"有毛細胞"は不動の彼らの特徴的な心尖部のバンドル、音のエネルギー1の検出と伝達に重要な要素に由来する。 OHCSは、電気的、機械的および化学的刺激、音響信号の内耳増幅2のための非常に重要な運動応答への応答に曲げ、形状、伸長、短縮して変更することができます。

ⅰ）electromotility、別名速い運動性、密にOHC細胞膜にパックされたモーター蛋白質の電気駆動型コンフォメーション変化から派生したマイクロ秒の範囲の長さの変化、およびii）ゆっくりと運動性、の形状変化：OHCの刺激は、2つの異なる運動性応答を誘導秒のミリ秒は、細胞骨格再構築2、3を含む範囲です。 OHC曲げはelectromotility、そしてどちら側細胞膜、またはこれらのモータータンパク質の非対称な電気刺激（例えば、細胞の長軸に電界の垂直付き）4のモータータンパク質の非対称分布の結果に関連付けられています。機械的および化学的刺激は、細胞のイオンの状況の変化及び/またはそれらの環境にも細胞膜に埋め込 ​​まれたモーター蛋白質5、6を刺激することができるにもかかわらず、本質的に遅い運動性応答を誘導する。 OHC運動性応答は蝸牛増幅器の不可欠な要素、音響周波数（およそ人間の20 Hzから20 kHzから）で、これらの運動性応答の定性的および定量的な分析であるため、研究7聴覚の分野において非常に重要な問題です。

ハイスピー​​ドビデオカメラ、LEDベースの照明システム、および高度な画像解析ソフトウェアを組み合わせた新たなイメージング技術の開発は外部の交流電界（EAEF）に信頼性の高い定性および孤立OHCSの運動性応答の定量的研究を実行する機能を提供します。 8。これは、前のアプローチ9-11限界のほとんどを回避する有効な手段シンプルかつ非侵襲的方法である。また、LEDベースの照明システムは、サンプルのわずかの熱影響で極端な明るさを提供し、ビデオ顕微鏡の使用により、光学解像度は、従来の光顕微鏡技術12と比べて少なくとも10倍高いですので。例えば、実験的なセットアップはここで説明すると、約20nmのセルの長さの変化は、日常的かつ確実に10 kHzの周波数で検出することができ、そしてこの決議は、さらに低い周波数で改善することができます。

我々はこの実験的なアプローチはOHCの運動の基礎となる細胞および分子メカニズムの理解を広げるのに役立つと確信しています。

プロトコル

1。 OHCSの分離

  1. モルモット、マウスまたはあなたの哺乳動物のモデルから、側頭骨を採取して、この手順を開始する。
  2. 次に、蝸牛を露出させるために槌ニッパーを使用して側頭骨を開き、リーボビッツL - 15でそれらを浸す。骨のシェルを保ったまま、慎重に骨の過剰を削除します。これは任意の哺乳動物種の頭骨に適用される一般的な手続きであるのに対し、非常に小さな動物から頭骨を扱うときに、テクニックに若干の変更が必要になる場合があります。古い動物では水疱は、通常の手順に追加の合併症を導入し、石灰化しています。
  3. 顕微鏡観察下では、＃11手術用メスの刃、マイクロポイントのピックと細かいピンセットの先端を使用して蝸牛と削除血管条とスパイラル靭帯の先端領域を開きます。
  4. ピンセットを使って人工内耳蝸牛のコルチ器官を脱いで、そして5分間、室温でL - 15で1mg/mlコラゲナーゼでそれを置く。
  5. 蝸牛の基底回転からOHCSが必要な場合は、ピックと蝸牛の基部をカバーする骨のシェルを削除し、コルチ器官を削除する前に、手術用メスの刃を使用して、側頭骨からスパイラルを分離。
  6. 50μLハミルトンシリンジを使用して録音室にコルチ器官を転送する。その後、針を通して逆流して細胞を解離する。

2。実験的なセットアップ

  1. 外部交互電界（EAEF）ジェネレータと画像キャプチャシステム（図1）とのリンクの図。制御回路は、特別にハウス耳研究所のエンジニアリングのコアで実装されました。
  2. 本実験で用いた実験では、代替のLEDベースの照明システムとAxiovert 135TV倒立顕微鏡（Zeiss、ソーンウッド、ニューヨーク州）で構成されています（ハイパワーLEDはシステム36AD3500、ライトスピードテクノロジーズ、キャンベル、カリフォルニア州）、二つの電子マニピュレーター（エッペンドルフ"Patchman"、ドイツ）、ケラーポートと三眼鏡ポートの追加の通常のCCDカメラでパソコン制御の超高速フォトロンFASTCAM X 1024 PCIカメラ（フォトロン米国株式会社）。 FASTCAMのカメラは、高い周波数（100,000 fpsまで）と高解像度（例えば、これは1,000 fpsの、10,000 fpsで512 × 128、18000 fpsで384 × 96、および1024 × 1024ピクセル）で画像をキャプチャすることができます。 CCDカメラが別のモニタに接続されているのに対し、ハイスピー​​ドカメラによって提供された画像は、直接、PCモニタで観察される。アナログ低消費電力とハイパワーデジタル：LEDベースの照明システムは、2つの異なるモードで動作します。すべての準備作業（電極の位置、セルの位置、ピント、など）は、低消費電力アナログモードを使用して実行されます。ハイパワーの照明は、カメラのシャッターの開口部でオンにし、放熱を促進する、シャッターの開閉ではオフになっています。また、同じPC上で実行されている、ハウス耳研究所エンジニアリングのコアで開発された自家製のソフトウェアは、ハイスピー​​ドカメラ、LEDベースの照明システム、およびEAEFのトリガを制御します。必要に応じて前面のポートで、従来のデジタル写真のカメラは、静止フレームが可能になります。 （図2 A）。
  3. 電極（0.8 mmの先端の距離が二つ0.25ミリメートル径のAg線）は、電子マイクロマニピュレータのいずれかを使用して位置に駆動されています。電極の位置を視覚的および顕微鏡画像を通じて監視され、イメージの焦点面での変化は、電極が、実験室の底に触れたことを示しています。当初は、電界が外部電極を用いて校正されています。この電極は、電界の"マップ"を生成し、異なる点の電位を測定します。単一の孤立した外有毛細胞が適用EAEFにその長手方向軸に平行に電極の先端の間に配置されている場合、それは伸長し、電界の同じ周波数で短縮移動します。セルがフィールドに垂直に配置されている場合OHC応答（曲げ）の異なるタイプが観察して調べることができる。 （図2 B）

3。 EAEFの刺激と画像キャプチャ

  1. つの異なる刺激プロトコルが（図3）選択可能です。
    1. 連続的な単一周波数（図3 A）。刺激モード、周波数、振幅、波型は自家製制御ソフトウェア（赤い丸）を使用して選択できることに注意してください。
    2. バースト単一周波数（図3 B）。バーストの間にバーストとギャップの長さも選択可能です。
    3. リニア掃引（図3 C）。最初と最後の選択可能な周波数は。
    4. マルチ刺激（図3 D）。単一の周波数とリニア掃引は、単一の実験で組み合わせることができます。対応するパラメータを選択した後、制御ソフトウェアは、システムを設定し、オペレータは、単一のボタンをクリックすることで光同期した映像を録画し、細胞の刺激を開始することができますコンピュータの画面。
  2. 画像は、高周波でのさらなる分析のためのAVI形式でキャプチャされます。

4。代表的な結果

  1. この映画では、2つの絶縁外有毛細胞は、それらが彼らの縦軸に、それぞれ、平行または横である外部交互に電界で刺激されている長さや曲率の変化を示す。 （ムービー＃2）。
  2. OHCS運動性応答はProAnalystソフトウェア（Xcitex社、ケンブリッジ、MA）を使用してオフラインで分析されます。このソフトウェアの"機能のトラッキング"機能は、2つのポイントフレームごとに（図4）の間の距離を提供します。とセル（基礎柱、緑の色）のベース、頂点（赤い色クチクラプレート）で選択したポイント間の距離を短くするセルの間に小さく、細胞の伸長とともに増加。映画の長さは、フレームごとの変化を分析するソフトウェアを示しています。画像の下部にあるパネルには動きのトレースを示します。この例では、長さの変化量は6.5画素程度です。
  3. ProAnalystソフトで"輪郭トラッキング"機能は、セルのエッジを検出し、自動的に光学部（図5）の面積を測定することができます。
  4. ポリスチレン微小球は、ランダムにお風呂の溶液に添加し、しっかりと形質膜（図6）に取り付けます。別のミクロスフェアを同時に選択することができ、ソフトウェアは自動的にこれらのすべてのフレーム単位で追跡することができます。このように、細胞はセクションに分かれ、各セクションの運動性は、独立して評価することができます。 （図6 A）
  5. 選択して、微小球は、細胞画像の横方向の端に位置し、各セグメントの長さの変化と1つのセグメントの点の角度の変化は、（曲げ）他にも独立して評価することができます。 （図6B）

図1
図1。EAEFジェネレータと画像キャプチャシステムとのリンクの図。

図2
実験装置の図2）の画像。顕微鏡ステージのB）の詳細、漫画は、電極と電界と平行に長手方向の軸とそれらの間に配置された単一のOHCを描いたと。

図3
図3。単周波数刺激用に設定された自家製の制御ソフトウェアの）ユーザインタフェース。選択されたパラメータは、赤色の丸で囲まれている。 B）自家製制御ソフトウェアのユーザインターフェースは、バースト単一周波数の刺激のために設定。 C）リニアスイープの刺激のために設定されたホームメイドの制御ソフトウェアのユーザーインターフェースは。マルチ刺激用に設定された自家製の制御ソフトウェアのD）のユーザインタフェース。

図4
図4。細胞の単ベースで設定した二つの点とOHCのフレーム（緑）と頂点（赤）、それぞれ、ProAnalystソフトウェアの"機能の追跡"機能を使用する。セルの下の曲線は電気刺激に関連付けられ、選択したポイント間の距離の周期的な変化を示しています。縦棒の異なるフレームを移動は、個々の分析のために選択することができます。

図5
図5。ProAnalystで"輪郭トラッキング"機能は、セルのエッジを検出し、自動的に光学部の面積を測定する。

図6
図6。ポリスチレン微小球（上）、および5つの微小球と同じ画像を個別に（下）を選択した状態で飾ら孤立OHCの）撮影画像。異なる色は、それぞれのミクロスフェアに割り当てられていた、と彼らの変位は、個別に、自動的にフレームごとに追跡することができる、分析と比較した。 B）任意の長さのセグメントがポリスチレン微小球は、細胞の端に位置し、及びこれらのセグメントの長さの変化だけでなく、他の人への1つのセグメントの点（セルが曲げ）の向きの変更が自動的にでフレームを評価することができますを選択することによって定義することができます。画像解析ソフトウェアとのフレーム。

モルモットのOHCSの動画1。分離。 ビデオを見るためにここをクリック

映画は2。典型的なelectromotilityと曲げ応答を示すEAEFにOHCSの平行と垂直に。 ビデオを見るにはここをクリック

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ディスカッション

ここに示した実験方法は、細胞の動きに何ら制限なくkHzの範囲でOHC運動性応答を推定することができます。異なる刺激プロトコル、追加のマーカー（ミクロスフェア）は、電界に対するセルの向きにも変化として、それは可能な限り以前にアクセスできない細部のレベルでOHCの運動の新たな側面を調査すること。他の方法は、例えば、フォトダイオード9またはレーザドップラ振動計10を使用して 、それらは、細胞の位置の厳密な制御を必要とする。ここでは、対照的に、すべての測定は、同じセルに属する点の間で実行され、すべての変位が唯一の細胞の形状ではなく、参照の外部フレームに関連したそれらの動きと変化に関連付けられています。断面OHCの領域の信頼性の測定も容易にOHCの体積の急激な変化の推定を可能になる、得られる。加えて、より速く、より高感度カメラと優れた画像解析ソフトウェアの継続的な開発は、方法の質の継続的な改善を保証する。技術の欠点、原形質膜間の電位で制御なしには、kHzの範囲のOHCの運動性を評価するために使用されるすべての現在の方法で共有する制限です。

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開示事項

利害の衝突は宣言されません。

謝辞

P30 DC006276リサーチコア、およびHEIをNIDCD、健康補助R01DC10146/R01DC010397の国立研究所によってサポートされる作業。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHや高等教育機関の公式見解を示すものではありません。著者らは関心のない既存のまたは潜在的な競合を宣言しません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント（省略可能）
リーボビッツのL - 15 ギブコ 21083
コラゲナーゼ（タイプ4） シグマアルドリッチ C5138 L - 15で1mg/mL

参考文献

  1. Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
  2. Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
  3. Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
  4. Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
  5. Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
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  7. Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
  8. Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
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  11. Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
  12. Inoué, S. Video Microscopy. , Plenum Press. New York. (1986).

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