In vivoマウス肝灌流:門脈を介してげっ歯類の肝臓に溶液を注入する方法

要約

出典:Cabral, F., et al. マウス肝灌流からの肝細胞および正弦波内皮細胞の精製。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、肝細胞を単離する前にコラゲナーゼ溶液を使用して門脈をマウスの肝臓灌流する手順について説明しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 準備

1. 溶液と培地の調製
   1. すべての培地とバッファーを、材料表に従って調製します。
2. 楽器の準備
   1. 42°Cのウォーターバス(>10 L)、可変速度のペリスタルティックポンプ、フラスコを保持するためのクランプを設置します。湾曲したはさみと鉗子を準備します(図1)。
   2. ウォーターバス上またはウォーターバスに隣接して、発泡スチロールパッド(50 mL円錐ラック)を備えた天板(約38 x 26 cm)を設置し、その上に20 x 20 cmのピースにカットされた吸収性アンダーパッドを重ねます(図1)。
   3. マスキングテープ(5〜8 cm)を近くに置きます。カットしてすぐに使用できる20cmのポリエステルミシン糸を近くに置きます。引き込み式針付きのプラスチックカテーテル(7 mm x 19 mm、図1)を入手します。
3. ガラス製品の準備
   1. クランプを使用して、200 mLの1x PBSが入ったウォーターバスに1 Lフラスコを置き、2つの1 mLピペットが溶液に入るストッパーを付けて固定します。ゴム製のコルクは、閉回路内の流体の再循環を可能にするためにノッチが付けられています。
   2. 別のクランプを使用して、45 mLのバッファー2を含む125 mLフラスコと、フラスコの底近くの液体にある2つの1 mLピペット、および液体の上に留まりフラスコに酸素を吹き込むもう1つのピペットを備えたストッパーを置きます
      手記：ストッパーの各ピペットには、チューブを簡単に交換できるように、端にクイックディスコネクトアダプターが取り付けられています。酸素は、液体に浸されていないストッパーのピペットを介して両方のフラスコに穏やかに流れ込みます。
   3. 2つの滅菌結晶化皿を取っておきます。

2. 動物の手続き

1. PBSおよびBuffer 2溶液をウォーターバスで42°Cに温め、閉回路でチューブ内でPBSを少なくとも20 mL/分間循環させて、液体ラインを保温します。余分なチューブをウォーターバスに浸して、できるだけ42°Cに近づけ、チューブのオス端をPBSを含む1Lフラスコに排出します。
2. 吸収性アンダーパッドにコットンボールを置き、トランスファーピペットを使用して、約2mLの30%イソフルラン(ポリエチレングリコール200で構成されているため、イソフルランの蒸発速度が低下します)をコットンボールに加えます。
3. マウスの尻尾をつかみ、結晶化皿の1つに入れてから、皿を綿球にすばやくひっくり返して、マウスが麻酔を吸い込むための小さなスペースを確保します。マウスの呼吸数を観察し、マウスが効果的に麻酔下にあることを確認します.
   手記：呼吸数は遅く、深く、尾は弛緩し、足は麻酔下でのピンチテストに反応しない必要があります。詳細については、IACUC ガイドラインを参照してください。
4. マウスが麻酔を受けている間(これには1〜2分かかります)、プランジャーを引き出し、小さな綿球を挿入して、10mLシリンジのバレルを準備します。1〜2 mLの30%イソフルランをトランスファーピペットでバレル内のコットンボールに加え、マウスが意識を失うのを待ちながら、バレルの開放端をテーブルに置きます。.
5. 結晶化皿をすばやく取り出し、マウスを背中にひっくり返し、注射器のバレルを鼻の上に置きます。呼吸数、つま先をつまむ、尻尾がたるんでいることを再確認してください。つま先のつま先つまみや弛緩した尻尾に対する反応は、マウスが完全に麻酔下に入っていないことを示しています。シリンジのバレルを鼻の上に置いて、意識を失わせます。
6. マウスの足に画鋲を通し、手足を仰臥位に伸ばします。腹部と胸郭を70%イソプロパノールまたはエタノールで濡らします。
7. まっすぐな鉗子を片手に持ち、腹部の付け根近くの皮膚を持ち上げます。もう一方の手で、テントの皮膚と腹膜を切ります。切開部は水平またはテントを張った皮膚の基部を横切って行う必要があります。腸にアクセスするために、皮膚と腹膜のすべての層を必ず切り裂いてください。腹部の周りを両側の胸郭まで横方向に切り取り、臓器を傷つけないようにします。
8. 下部胸郭を横切って皮膚のフラップを切り取ります。鉗子の裏側で腸を右に動かして門脈を露出させます.
   手記：動物からの出血は最小限であるべきです。動物はまだ呼吸していて、深い麻酔下にあるべきです。
9. 閉じた湾曲した鉗子を、肝臓と上膵頭十二指腸静脈の間の門脈の下に置きます(図2の矢印)。
10. 門脈の下にある鉗子を開きます。糸をつかみ、門脈の下の中央に来るように慎重に引き抜きます。ポータル静脈を締め付けずに、ポータル静脈の周りにオーバーハンドノットを結びます。
11. 湾曲した鉗子を門脈の下に置き、マウスの尾に向かってゆっくりと引っ張って静脈をまっすぐにします(図3A)。
12. もう一方の手でカテーテルを持って、針の斜角を上向きにして、鉗子の近くの門脈の下部と平行に置きます(図3B)。
13. 針で静脈をそっと穿刺します(図3C)。針の斜角が静脈の内腔にあることを確認します。バネ仕掛けの針を引っ込め、ベベルが静脈分岐領域に近づくまで、ポリマーカテーテルを静脈に押し込み続けます。これは肝臓内にあります。カテーテルが正しく留置されていれば、血液の逆流が見えます。(図3D)。
14. オーバーハンドノットを締めてカテーテルに引き下げ、安定させます。すぐにポンプ速度を20 mL / minから4 mL / minに下げ、別の主要な血管を切断してドレナージします。最適な結果を得るためには、腹部大動脈を切除します。
15. チューブのオス端をカテーテルのメス端に配置します(図4A)。ラインに気泡がないことを確認してください。カテーテルが肝臓に押し込まれたり、静脈から出たりしないように注意してください。糸の配置は必須ではありませんが、静脈からの逆流を防ぎ、カテーテルを正しい位置に保つのに役立ちます(図4B、C)。
16. マスキングテープを使用して、チューブをアンダーパッドに固定します。まっすぐな鉗子を使用して流出血管を圧迫し、肝臓を数回膨らませて、すべての血液が排出されていることを確認します(図4D).
    手記：標準的な実験用テープは機能しない場合があります。ただし、マスキングテープは濡れた状態でもアンダーパッドに付着したままになります。

3. 肝臓灌流

1. 肝臓がPBSで洗い流されている間に、約24 mgのコラゲナーゼIV型を量り、45 mLのバッファー2が入ったフラスコに入れます。コラゲナーゼが完全に溶解するようにフラスコ内の液体を渦巻き、フラスコをクランプに戻し、フラスコの液体を含む部分が水に完全に浸されるようにしてください。
2. 肝臓がPBSで洗い流されるときの色の変化を観察します。アウトフローチューブを1Lフラスコから125mLフラスコに交換します。気泡が肝臓に流れ込まないようにしてください。
3. 灌流バッファーが肝臓に到達したら、流出血管を短時間しっかりと絞って血管内に圧力を蓄積し、この液体が肝臓のすべての葉を満たすようにします。ドレナージを長時間遮断すると、肝臓を取り巻く薄い結合組織(グリッソン嚢)が破裂し、肝臓の毛細血管床内の液体の灌流または流れが破壊される可能性があるため、注意してください。
4. コラゲナーゼを含むバッファー2を肝臓で灌流し、45 mLすべてが組織を通過するまで待ちます。
   手記：成功した場合、グリッソン嚢は実質または肝臓組織から分離され、肝臓自体は非晶質に見えるはずです。
5. 約10 mLのBuffer 1をもう一方の結晶化皿に加え、マウスの隣に置きます。
6. カテーテルを取り外し、ポンプの電源を切ります。
7. まっすぐな鉗子とはさみで、マウスから肝臓を切り取ります。コラゲナーゼの消化が非常に効率的であった場合、マウスから肝臓をすくい取り、バッファー1に入れるために、清潔で滅菌済みのスプーンを手元に用意する必要があるかもしれません。

結果

図1:灌流スイートの概略図。フラスコはクランプ(図には示されていません)によって所定の位置に保持されます。処置中に液体が入ったチューブが1Lフラスコから125mLフラスコに交換されるのは、赤い点線で表されます。酸素供給はフラスコ内の溶液に直接泡立たないことに注意してください。コルクには、ノッチ内にチューブを挿入した状態で閉回路の流体の流れを可能にするために、ノッチを付ける必要もあります。これは、チューブのウォームアップ中や、チューブ内のすべての空気を排出するために重要です。エアブリードは、Tygonチューブとピンチクランプに接続されたT型コネクタで構成されており、システムをすばやく開閉できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1L三角フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	S63274
250 mL 三角フラスコ	フィッシャーサイエンティフィック	S63271
シリコーンチューブ	コール・パーマー	96400から14	このチューブは、フラスコからポンプを通ってTコネクタに通じ、次にカテーテルに接続された1.0mLシリンジに通じています。
タイゴンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	R3603	96400-14とピペットおよびTコネクタの間のアダプタとして使用されます。これは、酸素チューブにも使用できます。
Tコネクタ	コール・パーマー	EW-06294から82
クイック切断	フィッシャーサイエンティフィック	〒6150-0010
ピンチクランプ	フィッシャーサイエンティフィック	〒6165-0002
Masterflex L/S 可変速ポンプ モデル 7553-70	コール・パーマー	EW-07559から00	可変速度のペリプラスチックポンプ
ポンプヘッド 7014-20	コール・パーマー	EW-07014から20
ガラス目盛り付き1.0 mLピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13〜678
湾曲した非鋸歯状のはさみ	ファインサイエンスツール	14069から12
デュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11252から20
湾曲した鉗子	ファインサイエンスツール	13009-12
10 mLシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	03-377-23	注射器のバレルのみが必要になります
スターライズドスプーン	ホームサプライストア
コットンボール	ホームサプライストア
ポリエステルミシン糸	ホームサプライストア
マスキングテープ	ホームサプライストア
画鋲	ホームサプライストア
発泡スチロールパッド	50 mLコニカルラック
クッキー/天板	ホームサプライストア
吸収剤アンダーパッド	フィッシャーサイエンティフィック	14*206*64
19Lウォーターバス	フィッシャーサイエンティフィック	TSCOL19
BD Insyte Autogaurd シールド IV カテーテル 24 ゲージ	ベクトン・ディキンソン	381412	引き込み式針付きプラスチックカテーテル
結晶化皿100x50	VWRの	89000から290
ポリスチレン製シャーレ	シグマ・アルドリッチ	P5481-500EA
50 mLコニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	12-565-270
目盛り付きピペット(5 mL)	フィッシャーサイエンティフィック	170355
目盛り付きピペット(25 mL)	フィッシャーサイエンティフィック	170357
イージーストレーナー 100 μM	グライナーバイオワン	542000	100μmフィルター
イージーストレーナー 40 μM	グライナーバイオワン	542040	40μmフィルター
試薬
名前	化合物	グラム(g / L)	ミリモル (mM)
緩衝液1、pH 7.4	NaCl	8.3	142
	KClの	0.5	6.7
	ヘープス	2.4	10
	BSAの	15	0.226
緩衝液 2、pH 7.4	NaCl	3.9	66円74銭
	KClの	0.5	6.71
	CaCl2	0.7	6.31
	ヘープス	24	100
	BSAの	15	0.226
	フェノールレッド	0.01	0.03
PBS; pH 7.4	NaCl	8	137
KClの	0.2	2.7
Na2HPO4-7H2O	1.15	4.3
KH2PO4	0.2	1.4
その他の試薬
名前	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼIV型	シグマ・アルドリッチ	C5138
イソフルラン	アブカム	ab144581

の 型 (代表) の 名 名 名 の 名 名 名 の 名 名