マウスモデルにおけるCalvarial Window生成:マウス頭蓋骨の上部に窓を作るための外科的処置

要約

出典:Geisler, J. A. et al.頭蓋内注射と磁気共鳴画像法による脳転移のモデリング。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、マウスモデルの脳にアクセスするための頭蓋窓を作成する外科的処置について説明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術用の定位ユニットを準備する

1. すべての麻酔器、デジタルバーニアスケール、デジタルインジェクターの電源を入れます.
   手記：すべての手術器具は、手術前に適切に洗浄および滅菌する必要があります。
2. 生物学的安全キャビネットに誘導チャンバーアタッチメントを備えた麻酔器を利用します(図1A)。
3. 麻酔器のすべてのチューブが定位フレーム(図1B、挿入図1C)に接続されており、チューブのクランプが使用されているすべてのユニットに対して開いていることを確認します。手術に使用されない定位フレームにつながるチューブのクランプをすべて閉じます。
4. マウスの体重に基づいて、麻酔器をメーカーが推奨するノーズコーン流量に設定します(例:25 gの動物の体重:ノーズコーンの流量34 mL / min).
   手記：この定位セットアップに含まれるヘッドホルダーは、成体マウスにのみ推奨されます。定位設定に含まれるメーカーの推奨事項に従っていることを確認します。
5. シリンジにあらかじめ充填された適切な麻酔薬(イソフルランなど)が麻酔器に取り付けられていることを確認します(図1B).
   手記：シリンジを過剰にプライミングすると、手術中にマウスに麻酔が過剰に供給され、麻酔薬の過剰摂取につながる可能性があります。
6. ステージロックをひねり、ドリルビットアダプターと1mmドリルビットを各ドリルに挿入してドリルを準備し、ビットロックを手動で締めてドリルをロックします。
7. 定位フレームにドリルを取り付けます(図1C)。

2. 定位フレームにマウスを配置する

1. マウス(例えば、イソフルラン)を前述の誘導チャンバーを用いて麻酔する。
2. 処置中、マウスを深い麻酔面に維持します。機械によって投与される麻酔の割合は、流量、刺激の程度、体温など、さまざまな要因によって異なります。リズミカルな呼吸を評価することにより、麻酔の深さについて手順全体を通してマウスを頻繁に監視します(動物はあえぎません)。眼瞼反射の欠如(綿の先端アプリケーターで刺激したときのまぶたの羽ばたき);つま先をつまむことの欠如(つま先をつまむという有害な刺激による手足の引きこもり).
   手記：マウスの系統が異なれば、麻酔に対する反応も異なります。
3. マウスが適切な深部麻酔面に来たら、マウスを定位器に移します。マウスが定位固定装置にある間は、体温と適切な麻酔面を維持するために、加熱パッドを使用してください。
   手記：薄型化を実現するために、逆ピペットチップボックス(図1Dのマウス昇降ボックス)内に配置された空気作動式ハンドウォーマーを使用しています。
4. マウスの口を開き、定位フレームのノーズピースにあるマウスバーのトラフに歯を置きます(図2A)。マウスの鼻/口の上でノーズコーンをスライドさせます(図2B)。
   1. マウスの頭をマウスバーと同じ高さにして置きます。コットンチップアプリケーターの鈍い端で口をそっと開き、所定の位置にスライドさせます。ノーズコーンがマウスの鼻に完全にあることを確認しないと、麻酔が適切に供給されません。歯がこの溝内に装着されていない場合、ノーズコーンはノーズにかみ合いません(挿入図2A)。
5. 滅菌綿棒を使用して、マウスの各目にアイ潤滑剤を塗ります。アイローションを塗布すると、角膜の乾燥が軽減され、角膜の損傷や角膜の外傷に関連する術後合併症の可能性が減少します。
6. マウスの頭蓋骨を安定させるには、左耳のバーを左耳の内側眼瞼に押し付け、定位フレームのネジを使用して所定の位置に固定します。次に、右イヤーバーを右耳の内側眼瞼にスライドさせ、定位フレームをしっかりとねじ込みます(図2B)
   手記：イヤーバーを配置するときは、マウスの頭が水平でまっすぐであることを確認してください。頭が曲がっていたり、角度がついていたりすると、注射は脳の間違った場所に置かれます。イヤーバーは、適度な手動プローブによる刺激で頭蓋骨が固定されるまでのみ締める必要があります。

3. Calvarial ウィンドウを作る

1. ベタジン溶液と70%エタノールをそれぞれ3回交互にパスして頭皮を準備し、洗浄します。手術部位が目に近接しているため、手術用スクラブの上にベタジン溶液を使用してください。
2. 滅菌メスを使用して、頭蓋骨の中央中央面に沿って皮膚を3mm切開します(矢状縫合線に沿って)。切開部での出血は最小限に抑える必要があります。万一発生した場合は、滅菌綿チップアプリケーターで出血部位に一定のしっかりとした圧力を>30秒間加えます。
3. ドリルを特定してブレグマに対して垂直に向け(図2C)、デジタルバーニアスケールをゼロにリセットします。
4. ドリルを矢状縫合糸の2mm外側、冠状縫合糸の1mm前方に移動します(図2C)。再現性を高めるために、矢状縫合線の左または右の位置がすべての動物で一貫していることを確認してください。
5. ドリルを最高速度に回します。回転ビットによる組織の損傷を避けるために、皮膚をドリルから離し、頭蓋骨へのドリルを慎重に開始します。カルバリアに約0.5mmの深さの穴を開けると、カルバリアウィンドウができます。ドリルを下げすぎると脳に穴が開いてしまうので注意してください。ドリルが動いている間に滅菌生理食塩水をドリル部位に落とすと、機械によって発生する熱を相殺し、周囲の組織に熱損傷を与える可能性があります。
6. 頭蓋窓ができたら、ドリルを慎重に持ち上げて定位フレームから取り外します。
7. 70%エタノールを使用してドリルビットを清掃し、再度使用する場合は取っておきます。そうでない場合は、ドリルビットを取り外し、70%エタノールに浸します。

結果

図1:定位および麻酔システム(A)生物学的安全キャビネット内の麻酔導入チャンバーのセットアップ。(B)麻酔器から定位装置上のノーズコーンまでの麻酔チューブを強調した定位麻酔薬送達セットアップ((C)の挿入図を参照)。緑の矢印は供給された麻酔ガスチューブを示し、青い矢印は清掃されたガスチューブを示します。(C)ドリルアタッチメント付き定位スタンド。挿入図は、麻酔チューブ(緑と青の矢印)、マウスバー、およびイヤーバーを示しています。(D)自動シリンジポンプとマウス昇降ボックスを備えた定位スタンド。このボックスは、マウスを適切な高さまで持ち上げ、体温を維持するために使用されるハンドウォーマーが入った逆ピペットチップボックスです。挿入図は、自動注入装置内のハミルトンシリンジの向きを示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
手術材料
ベタジン	パデュー製品	19-027132	ポビドンヨード、7.5%
ボーンワックス	外科専門分野	903	無菌で可鍛性のある蜜蝋とパルミチン酸イソプロピル
ブポノルフィンSR-ラボ	ズーファーム	該当なし	長時間作用型注射用鎮痛剤 5 mL (0.5 mg/mL) ポリメトリック製剤
コットンチップアプリケーター	ピューリタン	25-806 10WC	滅菌された長い茎の綿の先端アプリケーター
目の軟膏	プラルーベ	17033-211-38	潤滑性ワセリンおよび鉱物油ベースの眼科用軟膏
ハンドウォーマー	ホットハンド	HH2	空気活性化ヒートパック
イブプロフェン	アップ&アップ	094-01-0245	液体懸濁液中5mLあたり100mg
イソフルラン	ヘンリー・シャイン社	1182097	麻酔気化器で使用する液体麻酔薬
メス	インテグラミルテックス	4から410	#10使い捨てメスの刃
縫合	コヴィディエン	SP5686G	45 cmスウェッジ5-0モノフィラメントポリプロピレン縫合糸
脳定位固定装置ユニット
高速ドリル(フォアダム)	コップフ	モデル1474	最大38,000 RPM
マウスガス麻酔ヘッドホルダー	コップフ	モデル 923-B	歯の穴とノーズコーンを備えたマウスバー
破裂しないイヤーバー	コップフ	モデル922	マウスアプリケーションに適したイヤーバー
脳定位固定装置(Stereotaxic Instrument)	コップフ	モデル940	ベースプレート、フレーム、リニアスケールアセンブリ、デジタル読み出しモニター付き
麻酔器
SomnoSuite低流量デジタル気化器	ケントサイエンティフィック	SS-01	デジタル麻酔器
SomnoSuiteマウス用スターターキット	ケントサイエンティフィック	ソムノ・メシェキット	インダクションチャンバー、麻酔シリンジ2個、18インチチューブ、プラスチック製ノーズコーン、廃アネシェシアガスボンベ2個付属

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