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方法論記事

ミクログリア食作用アッセイ:iPS細胞マクロファージを用いた神経芽腫細胞のミクログリア食作用モデルを確立するためのIn vitroアッセイ

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2023年4月30日

この記事について

要約

出典:Hall-Roberts, H. et al. iPSCマクロファージによる死んだ神経芽腫細胞の食作用に対するIn vitro定量的イメージングアッセイ。J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオでは、人工多能性幹細胞を用いた神経芽腫のミクログリア食作用アッセイを行っています。このアッセイは、神経変性疾患におけるミクログリア機能の障害を評価するのに役立ちます。

プロトコル

1. pH感受性赤色蛍光色素による死んだSH-SY5Ysの標識

  1. まず、フェノールレッドフリーHEPES緩衝培地に懸濁した固定SH-SY5Y細胞から始めます。細胞を数え、必要な細胞の総数を2mLの低タンパク質結合チューブに取り出します。SH-SY5Y100万個につき、フェノールレッドフリーのHEPES緩衝培地を使用して、2 mLチューブ内の総容量を300〜500 μLに構成します。チューブを37°Cのウォーターバスで短時間温めます。
  2. pH感受性赤色蛍光色素STPエステル(材料表を参照)を再構成し、温かい2 mLの細胞チューブにSH-SY5Yあたり12.5 μgの色素を加えます。ピペッティングで穏やかに混合します。チューブを室温で30分間インキュベートし、光から保護します。
    手記：pH感受性色素のSTPエステル種は第一級アミンと反応するため、標識バッファーに遊離アミンが含まれていてはなりません。水性緩衝液への溶解度が限られている可能性があるため、DMSO溶解色素を添加して水性緩衝液を温め、すぐに混合し、沈殿物(光学顕微鏡下で暗い粒子)の兆候がないか調べてください。
  3. HBSS1 mLを加え、1200 x gで4°Cで7分間遠心分離し、上清を捨てて2 mLのHBSSで洗浄します。遠心分離を繰り返します。
  4. 上清を廃棄し、フェノールレッドフリーマクロファージ培地(材料表を参照)で細胞を200,000〜120万細胞/mLの濃度に再懸濁し、50μLが10,000〜60,000細胞になるようにします(つまり、iPS細胞マクロファージよりもSH-SY5Yが0.5倍〜3倍多い)
    手記：培地中のフェノールレッドはバックグラウンド蛍光を増加させるため、生細胞イメージングを行う場合はフェノールレッドフリー培地を使用する必要があります。染色されたSH-SY5Ysを数時間以上保管することは、評価されていないため、推奨されません。SH-SY5Yは氷の上に保管し、光から保護してください。

>2. iPSCマクロファージの染色

  1. 生物学的安全性キャビネットで、深赤色蛍光、細胞透過性、スクシンイミジルエステル反応性色素のマクロファージ培地に溶液を調製します(材料の表を参照)。Hoechst 33342 を追加します (資料の表を参照)。作業溶液を水浴中で37°Cに温めます。
  2. iPSCマクロファージ培地をマルチチャンネルピペットで細胞上清を無菌リザーバーにピペッティングして、iPS細胞マクロファージ培地を穏やかに吸引します。ステップ2.1で調製した色素溶液70 μL/ウェルを、マルチチャンネルピペットを使用してiPSCマクロファージに加えます。37°Cおよび5%CO2で1時間インキュベートします。
  3. フェノールレッドフリーマクロファージ培地で実験的治療を準備します。ネガティブコントロール治療として10 μMサイトカラシンDを含めます。インキュベーション後、iPSCマクロファージ培地をマルチチャンネルピペットで非常に穏やかに吸引し、100 μL/ウェルのHankの緩衝生理食塩水(HBSS)を加えて洗浄します。直ちに穏やかなピペッティングでHBSSを除去し、100 μLの培地±化合物を加えます。37°Cおよび5%CO2.
    で10分間〜1時間インキュベートします 手記：サイトカラシンDは強力なアクチン阻害剤であり、食作用をブロックします。24〜72時間など、より長いインキュベーションが必要な実験的治療については、ステップ2.1の前に、完全マクロファージ培地で100 μL/ウェルの処理を使用して実験的治療を実施します。プロトコルに従ってステップ2.1〜2.3に従って、細胞染色を行い、その後、残りの食作用アッセイで処理をフェノールレッドフリーマクロファージ培地に再適用します。

3. イメージング食作用

  1. 固定セルハイコンテントイメージング
    1. マルチチャンネルピペットを使用して、ラベル付きのSH-SY5Yをウェルあたり50 μLに加え、液体の端で各ウェルの側面に加えます。37°Cおよび5%CO2で3〜5時間インキュベートします。
    2. 食作用インキュベーション後、マルチチャンネルピペットでピペッティングして細胞上清を穏やかに吸引し、廃棄します。100 μL PBSで一度洗浄します。
    3. 2%パラホルムアルデヒド100μLを添加してプレートを固定し、室温で15分間インキュベー
      4. トします。
    4. ウェルを吸引し、100 μLのPBSを添加します。プレートシーラーとホイルで覆います。必要になるまで4°Cで保存してください。
      手記：アッセイプレートは、このように少なくとも1週間保存でき、シグナルの大幅な劣化はありません。これ以上の保管はテストされていません。
    5. ハイコンテントイメージング顕微鏡(資料の表を参照)の電源を入れ、画像キャプチャソフトウェアを開きます。画面上部のLoadアイコンをクリックして、アッセイプレートを顕微鏡にロードします。
    6. [セットアップ] タブを選択します。左上のボックスのドロップダウンメニューで、適切なプレートタイプを選択し、オートフォーカスオプションのTwo Peak(デフォルト)を選択し、対物レンズの40倍水、NA1.1を選択し、共焦点モードを選択し、1のビニングを選択します。
    7. 使用する前に、設定メニューから40倍の水の目標を洗い流してください。
    8. チャンネル選択ボックスで、+アイコンを使用してDAPI、Alexa 647、Alexa 568のチャンネルを追加します。これらを1μmの単一平面で測定するように設定します。アッセイプレートの染色効率のために時間とパワーの設定を最適化します.
      手記：ガイドラインとして、DAPIは露出200ミリ秒で電力100%、Alexa 647は露出1500ミリ秒で電力100%、Alexa 568は露出100ミリ秒で電力40%に設定します。
    9. チャンネルが同時に測定されていないことを確認するには、[Channel Sequence]をクリックしてチャンネルを分離します。
    10. ナビゲーション |レイアウトを定義し、測定ウェルを選択し、ウェルごとに9〜12個のフィールドを選択します。
    11. セットアップ中に、プレートマップ上の代表的なフィールドをクリックし、各測定チャンネルを順番にチェックして、チャンネルオフセットを調整して染色が存在し、画像に焦点が合っていることを確認します。
    12. データをサーバーにアップロードしてリモート解析を行うには、「Online Jobs」ボックスと該当するスクリーンネームをクリックします。これにより、イメージング後にデータをサーバーに自動的にアップロードできるようになります。
    13. 「Save」ボタンをクリックして、アッセイプロトコルを保存します。
    14. 上部の [Run Experiment] タブをクリックし、実験プレートに名前を付けて、[Start] をクリックします。

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mLコニカル遠心チューブ隼352096細胞の遠心分離用
2-20 μL、20-200 μL、100-1000 μLシングルチャンネルマイクロピペット
PBS中の4%パラホルムアルデヒドアルファ・アエサルJ61899細胞の固定に
6ウェルプレート、組織培養処理
AggreWell-800 24ウェルプレートSTEMCELLテクノロジー34815胚様体形成のためのマイクロウェル低接着24ウェルプレート
自動セルカウンター
卓上遠心分離機
卓上マイクロ遠心分離機
CellCarrier-96 Ultra Microplates、組織培養処理済み、黒色、96ウェル、蓋付きパーキン・エルマー605530296ウェル組織培養(TC)処理マイクロプレート、黒色ウェル壁、光学的に透明な底部、食作用アッセイ用
CellProfilerソフトウェア生細胞タイムラプス顕微鏡で得られた食作用画像を解析するためのオープンソースソフトウェアです。ウェブサイト(http://cellprofiler.org/)から無料でダウンロードし、このプロトコルはバージョン2.2.0を使用しました。
CellTracker ディープレッド色素サーモフィッシャーC34565iPSマクロファージの細胞質を染色するための深層赤色蛍光、細胞透過性、スクシンイミジルエステル反応性色素。CellTracker Deep Red色素をDMSOで2 mM(1.4 mg/mL)に溶解します。1 μMで使用し、DMSOストックをマクロファージ培地で希釈します。
クラス2層流安全キャビネット
CO2ガスボンベEVOS FL Auto用アクセサリー
CO2インキュベーター、37°C、5%CO2に設定
サイトカラシンDケイマン11330食作用アッセイのネガティブコントロール治療。DMSOで10 mMに再構成し、アリコートを-20°Cで保存し、さらなる凍結融解サイクルを避けてください。最終濃度10μMで使用してください。
DMEM/F12ギブコ11320074SH-SY5Yメディアのコンポーネント
DMSOのシグマD8418CellTracker および pHrodo 色素用の溶媒
ウシ胎児血清シグマF4135SH-SY5Yメディアのコンポーネント
Geltrex LDEVフリー、hESC認定、低成長因子基底膜マトリックスインビトゲンA1413302iPS細胞培養のためのhESC修飾基底膜マトリックス
GlutaMAX サプリメントギブコ〒35050-038工場およびマクロファージ培地の両方の成分
HBSSのロンザBE10-547Fハンクのバランスの取れた塩溶液を洗浄ステップに
ヒト組換えIL-3ギブコPHC0033工場およびマクロファージ培地の両方の成分
ライブセルイメージングソリューションサーモフィッシャーA14291DJ死んだSH-SY5Ysの標識のためのフェノールレッドフリーHEPES緩衝媒体
低タンパク質結合性2mLチューブエッペンドルフ30108.132SH-SY5Ys染色用
M-CSFのサーモフィッシャーPHC9501工場およびマクロファージ培地の両方の成分
mTeSR1 ミディアムSTEMCELLテクノロジー85850iPSC メディア
マルチチャンネル20-200 uLピペット96ウェルプレートのリキッドハンドリング用
NucBlue Live ReadyProbes 試薬サーモフィッシャーR37605iPSマクロファージの核を染色するためのスポイトボトルに入ったHoechst 33342製剤は、マクロファージ培地で0.5滴/mLを使用してください。
オペラフェニックス ハイコンテント上映システムパーキン・エルマーHH14000000ハイコンテントイメージング顕微鏡、Harmonyソフトウェアバージョン4.9と併用。
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコ15140-122工場用、マクロファージ、SH-SY5Y用培地の成分
pHrodo iFLレッドSTP-エステルサーモフィッシャーP36011死んだSH-SY5Ysを標識するためのpH感受性赤色蛍光色素。pHrodo iFL Red STP Ester 粉末を DMSO 中で 5 mg/mL 濃度に再構成します。SH-SY5Y100万回ごとに、2.5 μL(12.5 μg)のpHrodo iFL Red STP Esterストックを、Live Cell Imaging Solutionに懸濁した温めた細胞に加えます。
血清ピペット充填機
T175フラスコ、組織培養処理iPSCマクロファージ前駆体を分化するための容器、通称「ファクトリー」
T75フラスコSH-SY5Y培養用容器
透明プレートシーラーグライナーバイオワン676001アッセイプレートの保管および輸送用
ウォーターバス、37°Cに設定
X-VIVO 15 培地 L-グルタミン、ゲンタマイシン、フェノールレッドロンザBE04-418F工場およびマクロファージ培地の成分
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine;gentamicinまたはphenol redを含まないロンザ04-744Qフェノールレッドフリーマクロファージ培地、添加物や成長因子を含まない食作用に使用

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