新鮮凍結神経膠腫組織からの核の単離:神経膠腫腫瘍サンプルから無傷の核を得る方法

要約

出典:Narayanan, A. et al.単一核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮凍結脳腫瘍からの核分離。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、新鮮な凍結神経膠腫組織から単一核を分離するプロトコルについて説明しています。単離された単核は、一核RNA(snRNA)シーケンシングやsnATAC(Single-nuclei Assay for Transposase-Accessible Chromatin)シーケンシングなどのシーケンシング技術の試料として使用でき、中枢神経組織の神経膠腫で観察される腫瘍間および腫瘍内の不均一性についてより深い洞察を得ることができます。

プロトコル

1. 組織の解剖と解離

1. 新鮮な凍結組織サンプル(10〜60 mg)を事前に冷やしたペトリ皿に移します。新鮮な冷凍ティッシュをかみそりの刃で氷の上で細かく刻みます。
2. 冷却した核溶解バッファー500 μLを、あらかじめ冷却した1.5 mLチューブに加えます。核溶解バッファーが入った1.5mLチューブに組織片を入れ、Douncer(材料表)に移します
   手記：2つのDounceホモジナイザー乳棒があります:初期サンプル削減のための「緩い」または「A」の乳棒と、完全なサンプル均質化のための「タイト」または「B」の乳棒
。
3. 摩擦が減少するまで、ティッシュピースを「緩い」乳棒で約20ストロークダウンします。破片が存在する場合は、100 mmストレーナによるろ過によりサンプルを事前に除去できます。
4. 「タイト」な乳棒で20ストロークダウンして、組織を完全に均質化します。
5. ホモジネート(約500μL)を予め冷却した2mLチューブに移します。冷やした溶解バッファー1mLを加えます。穏やかに混合し、氷上で5分間インキュベートします。ワイドボアのピペットチップで穏やかに混合し、インキュベーション中に1〜2回繰り返します。
6. 30 μmのストレーナメッシュを使用してホモジネート全体をろ過し、15 mLのFalconチューブに集めて、新しい予冷済みの2 mLチューブに戻します。通常、ホモジネート全体に対しては、単一のストレーナーで十分です。
7. 光学顕微鏡で確認し、大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。原子核は丸く、核膜が歪んではいけません。デブリが存在する場合は、原子核を再ろ過できます。
8. ベンチトップ遠心分離機で核を500 x gで4°Cで5分間遠心分離します。上清を取り除き、核を含むペレットを~50 μL残します。ペレットを別の1 mLの核溶解バッファーに穏やかに再懸濁し、氷上で5分間インキュベートします。
9. 核を500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を除去し、1x ホモジナイゼーションバッファー(HB)を500 mL加え(表1)、再懸濁せずに5分間インキュベートします。次に、核を別の1.0mLの1x HBに再懸濁します。
10. 核を500 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を取り除き、核を200 μLの1x HBに新しい2.0 mLチューブに穏やかに再懸濁します。

    表1:1xホモジナイズバッファー不安定溶液の調製(サンプルあたり2 mL)

    1x ホモジナイズバッファー不安定溶液 (サンプルあたり 2 mL)
    試薬	ファイナルコンク	サンプルあたりの容量 (μL)
    6x ホモジナイズバッファー 不安定	1倍	333.33
    1 mショ糖	320 mM	640.00
    50 mM EDTAの	0.1 mM	4.00
    NP40 10%	0.1パーセント	20円00分
    H2O		1006年27月

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール	シグマ	M6250
CaCl2	シグマ	21115-100ミリリットル
EDTA(0.5メートル)	サーモサイエンティフィック	R1021
Falcon 15 mL コニカル遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352096
MACS SmartStrainer (100 μm)	ミルテニーバイオテック	〒130-098-463
Mg(Ac)2	シグマ	63052から100ミリリットル
NP-40	アブカム	ab142227 (英語
核単離キット:Nuclei EZ Prep	シグマ	NUC101-1KT
セーフロックチューブ 1.5mL	エッペンドルフ	30120086
セーフロックチューブ 2.0mL	エッペンドルフ	30120094
蔗糖	シグマ	S0389
ワイドボアピペットチップ(1000μL)	テモ・フィッシャー・サイエンティフィック	2079GPKの

) シリーズ