グラジエント遠心分離法による核の精製:密度グラジエント遠心分離法を用いてインタクト核の超高純度画分を得る技術

要約

出典: Narayanan, A. et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオでは、グラジエント遠心分離を使用して単一核を単離するシンプルで効率的なプロトコルについて説明します。単離されたこれらの核は、シーケンシングやゲノム解析に使用できます。

プロトコル

1. グラジエント遠心分離

1. 200 μLの50%ヨージキサノール溶液(表1)を加えて、最終濃度25%ヨージキサノールを得ます。300mLにセットしたピペットで10回よく混ぜます。
2. 25%混合物の下に300 μLの29%ヨージキサノール溶液(表2)を加えます。P1000の細い先端を使用して、層の混合を避けます。
3. 29%混合物の下に300 μlの35%イオジキサノール溶液 (表3) を加えます。P1000の細い先端を使用して、層の混合を避けてください.
   注意： このステップでは、過度の容量の変位を避けるために、ピペッティング中にピペットチップを徐々に取り外す必要があります。
4. サンプルをスイングバケット遠心分離機に入れ、ブレーキをオフにして4°Cで3,500 x gで20分間回転させます。
5. 振らずにサンプルを静かに取り出し、光の下で観察します。第2層と第3層の間に、純度95%の核の透明な白い帯が見えるはずです(図1)。

2. 原子核の分離

1. 29%〜35%の間相で白い核が帯立つまで最上層を吸引します。
2. 核バンドを200 mLの容量で収集し、新しいチューブに移し、20 μmフィルターでろ過します(材料表)
   手記：核は、ろ過前に再懸濁する必要はありません。
3. 光学顕微鏡で確認し、大きな破片の除去と核膜の無傷性を確認します。原子核は丸くなければならず、核膜が歪んではいけません。
4. 血球計算盤でトリパンブルー染色を行い、snRNA-seq/snATAC-seqのアリコート核を用いて核をカウントします。

表1:6倍ホモジナイゼーションバッファー安定マスターミックスの調製

% してください

6x均質化バッファー安定マスターミックス
試薬	ファイナルコンク	100 の内容量 (mL)
1 M CaCl₂	30 mM	3.0
1 M Mg(Ac)₂	18 mM	1.8
1 M トリス pH 7.8	60 mM	6.0
H₂O(ヘリウムリウム)		89.2
室温に保ち、光に直接さらさないように

表2:1 Mスクロースの調製

ます

1 mショ糖

スクロース34.23g

78.5mLの水に溶かします

100mLまで水で満たし

表3:6倍ホモジナイズバッファー不安定溶液(サンプルあたり650μL)の調製

6x 均質化バッファー不安定溶液 (サンプルあたり 650 mL)
試薬	ファイナルコンク	サンプルあたりの容量 (μL)
6x ホモジナイズバッファー ステーブル	6倍	648.84
100 mM PMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)	0.1 mM	1.08
14.3 M β-メルカプトエタノール	1 mM	0.08

結果

図1:原子核単離のフローチャート。 フローチャートは、新鮮な凍結神経膠腫組織からの単一核の単離に関与するステップの簡単な見通しを提供します。腫瘍サンプルとヨウジキサノール/スクロース勾配後の核バンドの代表的な画像(赤い点線で囲んだ部分)を示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
EDTA(0.5メートル)	サーモサイエンティフィック	R1021
Falcon 15 mL 円錐形遠心分離機 チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352096
ヨージキサノール(別名Optiprep)	幹細胞技術	07820
NP-40	アブカム	ab142227 (英語
セーフロックチューブ 1.5mL	エッペンドルフ	0030120086
セーフロックチューブ 2.0mL	エッペンドルフ	0030120094
蔗糖	シグマ	S0389
ワイドボアピペットチップ(1000μL)	テモ・フィッシャー・サイエンティフィック	2079GPKの
ワイドボアピペットチップ(200 μL)	テモ・フィッシャー・サイエンティフィック	2069GPKの