凍結保存された組織切片の固定と染色:レーザーマイクロダイセクションのための凍結脳組織切片を処理する手順

Abstract

出典:Comba, A. et al. 腫瘍内不均一性、オンコストリーム、および浸潤の空間的および分子的特性評価のための神経膠腫サブリージョンのレーザーキャプチャマイクロダイセクション。J. Vis. Exp.(2020年)

この動画では、凍結マウス脳腫瘍組織を固定・染色する方法を紹介しています。処理された組織は、その後のレーザーキャプチャマイクロダイセクション中に特定の細胞集団を分化および取得するのに役立ちます。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 凍結保存された脳組織切片の固定と染色

1. RNAの完全性を保つために、使用するすべての器具をRNase洗浄液で洗浄してください。ヒュームフード内での固定および染色プロトコルに進みます。
2. 記載されている固定液を清潔なRNaseフリーの50 mLチューブで調製します。染色当日にすべての溶液をRNaseフリーの水で調製します。
3. 同じ日にレーザーマイクロダイセクションが実行され、100%、95%、70%、および50%のエタノール溶液を準備します。溶液を室温で密閉したチューブに保管してください。
4. 75%エタノール溶液中に4%クレシルバイオレットと0.5%エオシンYを調製します。溶液を1分間激しくボルテックスし、0.45μmのナイロンフィルターでろ過して、未溶解の粉末の痕跡を取り除きます。
5. ティッシュスライドを95%エタノールの入った容器に30秒間入れ、75%エタノールが入ったチューブにスライドを移し、スライドを30秒間そのままにしておきます。
6. スライドを50%エタノールに移し、25秒間そのままにしておきます。この時点でOCTは解消されます。スライドを4%クレシルバイオレット溶液に20秒間移し、次に0.5%エオシンY溶液に5秒間移します。
7. スライドを染料溶液から取り出し、スライドを濾紙で拭き取って乾かします。次に、スライドを50%エタノールに25秒間入れます。スライドを75%エタノールに25秒間移します。スライドを95%エタノールに30秒間移します。スライドを100%エタノールに60秒間移します。
8. スライドをキシレンですすいでください。キシレンの入った容器に移し、3分待ちます。
9. 封入剤(ピンポイントガムなど)をRNaseフリー水で調製します。マウス脳切片をマウントするには、封入剤をRNaseフリー水で1:10の比率で希釈します。
10. スライドをRNaseを含まない表面で室温で10秒間乾燥させます。キシレンが乾く前に、ティッシュ切片と一緒にスライドの取り付けに進みます。
11. スライド上の組織の上に埋込溶液を、滅菌済みでRNaseフリーの細い絵筆で穏やかに分散させます。10〜20秒待ってから、すぐに組織スライドを顕微鏡マイクロダイセクションプラットフォームに移します.
    注:マウントに使用する封入用液とRNaseフリー水の比率は、対象組織によって異なります。封入培地/水の比率は、RNAの完全性に影響を与えることなく、レーザーマイクロダイセクションのための神経膠腫組織の形態を維持します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
クレシルバイオレットアセテート	シグマ・アルドリッチ	C5042
エオシンY	シグマ・アルドリッチ	E4009
RNaseZap RNase除染ソリューション	フィッシャーサイエンティフィック	AM9780
PENメンブレンスライドガラス(2μm)	リエカ	1150518
Pinpointソリューション	ザイモリサーチ	D3001-1
ティッシュプラスOCTコンパウンド	フィッシャーサイエンティフィック	23-730-571