マウス脳からの単核細胞単離:脳常在単核細胞を単離するための密度勾配遠心分離技術

Abstract

出典: Ji, Z. et al. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infilte in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、密度勾配遠心分離を使用してマウスの脳から単核細胞の分離を行います。単離された単核細胞懸濁液は、さらなるダウンストリーム分析に使用できます。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脳からの単一細胞懸濁液調製

1. 密度グラジエント培地を PBS と 9:1 の比率で希釈し、15 mL のコニカルチューブに入れて、最終的な 100% 溶液を得ます。
2. EAEのピーク時にマウスに1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔をかけ、20 mLの滅菌氷冷PBSで心内灌流します。.これを達成するには、20 mLの注射器を使用して心臓の左心室にPBSをゆっくりと着実に注入し、右心房を開きます。
3. 頭蓋骨を鼻から首まで慎重に切り取り、頭蓋箱から脳を取り出して、50mLの円錐管に10mLのRPMIを入れます。よく混ぜて付着した赤血球を取り除きます。次に、吸引して培地を取り除き、10mLのRPMIを加えます。
4. 脳と培地を100mmの皿に入れます。カミソリの刃で細かく刻みます。
5. ディッシュから6 mLを氷冷した7 mL焼結ガラスホモジナイザーに、清潔なピペットで移します。ピペットに大量のティッシュを放置しないでください。少量は避けられません。
6. 最初に乳棒の「緩い」プランジャーを使用して脳を粉砕し、次に懸濁液が均一になるまで「タイト」プランジャーを使用し、事前に冷却した15mLの円錐管に....

Results

図1:単核細胞の単離のためのPercoll勾配セットアップの概略図。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ダウンスホモジナイザー	ウィートン	353107542
パーコール	GEの	17-0891-01