マウス脳からの単核細胞単離:脳常在単核細胞を単離するための密度勾配遠心分離技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脳からの単一細胞懸濁液調製

1. 密度グラジエント培地を PBS と 9:1 の比率で希釈し、15 mL のコニカルチューブに入れて、最終的な 100% 溶液を得ます。
2. EAEのピーク時にマウスに1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔をかけ、20 mLの滅菌氷冷PBSで心内灌流します。.これを達成するには、20 mLの注射器を使用して心臓の左心室にPBSをゆっくりと着実に注入し、右心房を開きます。
3. 頭蓋骨を鼻から首まで慎重に切り取り、頭蓋箱から脳を取り出して、50mLの円錐管に10mLのRPMIを入れます。よく混ぜて付着した赤血球を取り除きます。次に、吸引して培地を取り除き、10mLのRPMIを加えます。
4. 脳と培地を100mmの皿に入れます。カミソリの刃で細かく刻みます。
5. ディッシュから6 mLを氷冷した7 mL焼結ガラスホモジナイザーに、清潔なピペットで移します。ピペットに大量のティッシュを放置しないでください。少量は避けられません。
6. 最初に乳棒の「緩い」プランジャーを使用して脳を粉砕し、次に懸濁液が均一になるまで「タイト」プランジャーを使用し、事前に冷却した15mLの円錐管に注ぎ、氷の上に保ちます。
7. すべてのサンプルが均質化されたら、容量を見積もります。RPMIで容量を7mLに調整します。次に、氷冷した100%基底膜マトリックス3 mLを冷やした15 mLの円錐形遠心チューブに入れ、7 mLの脳ホモジネートを加えて、最終的な30%密度勾配培地を得ます。数回反転して混ぜます。渦巻きにしないでください。
8. シャープなインターフェースを確保するには、3 mLピペットを使用して、RPMIに70%アンダーレイ密度グラジエント培地1 mLを慎重かつゆっくりと加えます。
9. 800 x gで4°Cで20分間遠心分離し、加速を1に、減速を0に設定します。遠心分離後、上部相のほぼすべてを吸引し、上部のミエリンを完全に除去するように注意します(図1)。
10. インターフェースを新しい15遠心分離管に取り外します。RPMIで容量を10mLに調整します。
11. 500 x gで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引します。ペレットを~200 μLのフローサイトメトリー染色(FSC)バッファーに再懸濁します。

図1:単核細胞の単離のためのPercoll勾配セットアップの概略図。