マウス脳からの単核細胞単離:脳常在単核細胞を単離するための密度勾配遠心分離技術

要約

出典: Ji, Z. et al. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infilte in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、密度勾配遠心分離を使用してマウスの脳から単核細胞の分離を行います。単離された単核細胞懸濁液は、さらなるダウンストリーム分析に使用できます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脳からの単一細胞懸濁液調製

1. 密度グラジエント培地を PBS と 9:1 の比率で希釈し、15 mL のコニカルチューブに入れて、最終的な 100% 溶液を得ます。
2. EAEのピーク時にマウスに1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔をかけ、20 mLの滅菌氷冷PBSで心内灌流します。.これを達成するには、20 mLの注射器を使用して心臓の左心室にPBSをゆっくりと着実に注入し、右心房を開きます。
3. 頭蓋骨を鼻から首まで慎重に切り取り、頭蓋箱から脳を取り出して、50mLの円錐管に10mLのRPMIを入れます。よく混ぜて付着した赤血球を取り除きます。次に、吸引して培地を取り除き、10mLのRPMIを加えます。
4. 脳と培地を100mmの皿に入れます。カミソリの刃で細かく刻みます。
5. ディッシュから6 mLを氷冷した7 mL焼結ガラスホモジナイザーに、清潔なピペットで移します。ピペットに大量のティッシュを放置しないでください。少量は避けられません。
6. 最初に乳棒の「緩い」プランジャーを使用して脳を粉砕し、次に懸濁液が均一になるまで「タイト」プランジャーを使用し、事前に冷却した15mLの円錐管に注ぎ、氷の上に保ちます。
7. すべてのサンプルが均質化されたら、容量を見積もります。RPMIで容量を7mLに調整します。次に、氷冷した100%基底膜マトリックス3 mLを冷やした15 mLの円錐形遠心チューブに入れ、7 mLの脳ホモジネートを加えて、最終的な30%密度勾配培地を得ます。数回反転して混ぜます。渦巻きにしないでください。
8. シャープなインターフェースを確保するには、3 mLピペットを使用して、RPMIに70%アンダーレイ密度グラジエント培地1 mLを慎重かつゆっくりと加えます。
9. 800 x gで4°Cで20分間遠心分離し、加速を1に、減速を0に設定します。遠心分離後、上部相のほぼすべてを吸引し、上部のミエリンを完全に除去するように注意します(図1)。
10. インターフェースを新しい15遠心分離管に取り外します。RPMIで容量を10mLに調整します。
11. 500 x gで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引します。ペレットを~200 μLのフローサイトメトリー染色(FSC)バッファーに再懸濁します。

結果

図1:単核細胞の単離のためのPercoll勾配セットアップの概略図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダウンスホモジナイザー	ウィートン	353107542
パーコール	GEの	17-0891-01