ユビキチン化ペプチドの免疫親和性ベースの抽出:精製ペプチド画分からユビキチンタグ付きペプチドを選択的に抽出する技術

要約

出典: Bezstarosti, K. et al. ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出。 (2020年)

このビデオでは、複雑なペプチド混合物から残留ジグリシンペプチドを含むユビキチン化ペプチドを抽出し精製する方法について説明しています。提示された方法は、タンパク質中の元のユビキチン化部位を同定するのに役立つ可能性があります。

プロトコル

1. ユビキチン化ペプチドの抽出

1. 高 pH 逆相(RP)C18 クロマトグラフィーとポリマー固定相材料(300 Å、50 μM、材料表を参照)を空のカラムカートリッジにロードして、トリプシンペプチドを分画します。固定相のベッドサイズは、分画するタンパク質消化物の量に合わせて調整する必要があります。0.5 g の固定相材料を充填した空の 6 mL カラムカートリッジ(材料表を参照)を調製し、~10 mg のタンパク質消化物について調製します。タンパク質消化と固定相の比率は約1:50(w/w)である必要があります。
2. 調製したカラムにペプチドをロードし、0.1% TFAのカラム容量約10カラムでカラムを洗浄し、続いてカラム容量約10カラムのH2Oで洗浄します。
3. 10 mM ギ酸アンモニウム溶液(pH = 10)と 7%、13.5%、50% アセトニトリル(AcN)をそれぞれ 10 カラム容量で 3 つのフラクションに溶出します。すべてのフラクションを完全になるまで凍結乾燥します。
4. ユビキチン残存モチーフ(K-ε-GG)抗体をプロテインAアガロースビーズに結合させて、diGlyペプチドの免疫濃縮に使用します。ビーズのバッチあたりの抗体の正確な量は専有情報であり、製造業者によって開示されていないため、混乱を避けるために、ビーズのバッチには製造業者と同じ定義を使用することをお勧めします。これらのビーズの1バッチをPBSで2回洗浄し、ビーズスラリーを6等分に分割します。詳細な実験スキームについては、図1を参照してください。
5. ステップ 1.3 で回収した 3 つのペプチド画分を、50 mM MOPS、10 mM リン酸ナトリウム、および 50 mM NaCl (pH = 7.2) からなるバッファー 1.4 mL に溶解し、破片をスピンダウンします。
6. フラクションの上清をdiGly抗体ビーズに加え、ローテーターユニット上で4°Cで2時間インキュベートします。ビーズをスピンダウンし、上清を新しい抗体ビーズに移し、4°Cで2時間再度インキュベー
トします。
7. 上清を後回しのグローバルプロテオーム(GP)解析のために保存してください。
8. 各フラクションのビーズをGF/Fフィルタープラグ付きの200 μLピペットチップに移し、ビーズを保持します。ビーズの入ったピペットチップを、遠心チップアダプター付きの1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。ビーズを200 μLの氷冷IAPバッファーで3回洗浄し、続いて200 μLの氷冷Milli-Q H₂Oで3回洗浄します。各洗浄ステップの前に、カラムを200 x gで2分間スピンダウンしますが、カラムが乾かないように注意してください。0.15% TFAの50 μLを2サイクル使用してペプチドを溶出します。
9. C18ステージチップ(基本的には200 μLのピペットチップに2つのC18ディスクを取り付けたもの)を使用してペプチドを脱塩し、真空遠心分離を使用して完全に乾燥させます。

結果

図1:実験の概要。(A)実験的アプローチの概要。サンプルを調製し、トリプシン処理し、高 pH 溶出を伴う逆相クロマトグラフィーを使用して 3 つの画分に分画しました。市販のα-diGlyペプチド抗体ビーズの1バッチを6つの等しい画分に分割し、3つのペプチド画分を3つのビーズ画分にロードしました。diGlyペプチドを免疫精製、溶出、回収し、その後、フロースルーを残りの3つのフレッシュビーズ画分に移しました。収集された diGly ペプチドは、ペプチドフラグメンテーションのために最も強度の高いピークを最初に選択する 1 つのサイクルと、最も強度の低いピークを最初に選択する次のサイクルを組み合わせた 2 段階のスキームに従って、Lumos Orbitrap 質量分析計の質量分析によって分析しました。次に、nLC-MS/MS ランの全セットを MaxQuant を使用して分析しました。(B)画分の一つは、ユビキチン自身のK48修飾トリプシンd...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リシルエンドペプチダーゼ(LysC)	ワコーピュアケミカルズ	〒129-02541
NanoLCオーブン	MPIデザイン、MS Wil GmbH
N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass 分光 器	サーモフィッシャー
PLRP-S (300 Å, 50 μm) polymeric 逆相粒子	アジレント・テクノロジーズ	PL1412-2K01
PTMScan ユビキチン残骸 モチーフ (K-ε-GG)キット	細胞シグナル伝達技術	5562
Sep-Pak tC18 6 cc Vac カートリッジ	水	WAT036790	tC18材料を から取り外します カートリッジを充填する前のカートリッジ PLRP-S付き
デオキシコール酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	30970
トリスベース	シグマ・アルドリッチ	T6066
トリス-HCl	シグマ・アルドリッチ	T5941
トリプシン、TPCK処理	サーモフィッシャー	20233さん