DNA合成アッセイ:放射性トリチウム化チミジン取り込み法を用いて増殖細胞におけるDNA合成を評価する技術

要約

出典:Williams, M. et al. ヒト神経前駆細胞(NPC)における神経発達表現型の迅速な検出。 J. Vis. Exp.(2018年)

この動画では、放射性トレーサートリチウム化チミジンが細胞のDNAに取り込まれる様子を測定することで、神経細胞前駆細胞の増殖能力を判定しています。この手法は、特定の薬物や成長因子による治療後の細胞増殖の研究に使用できます。

プロトコル

1. NPCのメンテナンス

1. 150万個の細胞密度のNPCを、2 mLの100%増殖培地を含むECM模倣ゲルコーティングウェルにプレート
化します。
2. NPCを37°Cの湿った環境で5%_CO2でインキュベートします。
3. P3以下のNPC用、または融解したNPC用の培地に5 μMのROCK阻害剤を添加して、過剰な細胞死を防ぎます。24時間後にメディアを交換して、ROCK阻害剤を除去します。
4. 細胞がコンフルエントになる時期に応じて、4〜9日ごとに細胞を継代します。細胞は、皿の表面の底全体を覆う密集した単層になると、コンフルエントと見なされます。
5. NPCは、6ウェルプレートの1ウェルあたり1〜150万個の細胞の密度でプレートします。使用済み培地は48時間ごとに取り出し、2mLの100%拡張培地と交換します。

3. 神経前駆細胞DNA合成アッセイ

1. 100,000細胞/ウェルを24ウェルプレートにプレートし、トリプリケート/コンディションで評価します。
2. 放射性トリチウム化[³H]-チミジンを、培養物中で46時間後に各ウェルの培地(1.5 μCi/mL)に加えます。細胞を37°Cで2時間インキュベートします
   手記：放射性物質を使用する場合は、所属機関から研修を受け、放射能安全プロトコルに従い、放射性物質は適切に指定された廃棄物容器に廃棄してください。
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3. 時間後に放射性媒体を取り出し、適切に廃棄し、予熱した0.25%トリプシン-EDTA(0.5 mM)を300 μLを各ウェルに加え、37°Cで20分間インキュベー
トします。
4. セルハーベスタ(「材料」セクションを参照)とポンプの電源を入れ、ポンプ圧力が200 PSI未満であることを確認します。セルハーベスターのスペースに濾紙を置き、右隅をはがして用紙の向きをマークします。
5. セルハーベスターの収集チューブを空の「ブランク」トレイに入れ、プレウォッシュを押して濾紙を湿らせます。収集チューブをサンプルウェルに挿入し、実行(開始)します。
6. セルハーベスターがサンプルの収集を終了したら、クランプを持ち上げ、フィルターペーパーを進めて、すべてのサンプルセットに対して繰り返します。常に空の「空白」のプレートで予備洗ってください。
7. 濾紙を光源の下で乾燥させ、対応するバイアルをトレイにセットします。紙のチャドをバイアルに打ち抜き、各バイアルに2mLの液体シンチレーションカクテルを追加します。バイアルをキャップしてラベルを付けます。
8. 液体シンチレーションカクテルでバイアルを少なくとも1時間インキュベートしてから、シンチレーションマシンで1分あたりのカウント数(CPM)を読み取ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アドバンスドDMEM/F12ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒12634-010	100%拡張媒体のコンポーネント
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049
24ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	2021年05月	ポリスチレンプレート:NPC DNA合成アッセイに使用
ナチュラルマウスラミニン	インビトゲン	23017-015	コーティングプレート用基材:NPC DNA合成、S-Phase Entry、Cell Number Assaysに使用
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	抗生物質、膨張培地の成分
2.5%トリプシン(10X)	ギブコ	15090-046	10X酵素溶液
0.5メートルEDTA	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AM9261	DNA合成アッセイのための細胞を持ち上げるためのトリプシン溶液で使用されます
トリチウム化[3H]-チミジン	パーキンエルマー	NET027E001	放射性トリチウム、チミジン
Fisherbrand 7 mL HDPE シンチレーションバイアル	フィッシャーブランド	03-337-1	液体シンチレーション計数用バイアル
エコライト(+)	MPバイオメディカル	188247501	リキッドシンチレーションカクテル
LS 6500 多目的液体シンチレーションカウンター	ベックマン・コールター	〒8043-30-1194	液体シンチレーションカウンター
Skatron セミオートマチックセルハーベスター	Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.	タイプ11019	半自動セルハーベスター
グレードGF / C濾紙、Whatman	GEヘルスケアライフサイエンス	1822-849	ガラス繊維濾紙

の (英語) 年