NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

要約

出典:Williams, M. et al. ヒト神経前駆細胞(NPC)における神経発達表現型の迅速な検出。J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオは、ニューロスフィアからの神経前駆細胞の移動応答を研究するin vitroアッセイである神経前駆細胞ニューロスフェア移動アッセイを顕微鏡分析で示しています。

プロトコル

1. NPCニューロスフィアマイグレーションアッセイ

1. ニューロスフィア形成
   1. 100%膨張培地1mLをコーティング基材のない35mmディッシュに加えます。NPCをプレーティングする前に、37°Cで少なくとも15分間ディッシュをインキュベートします。細胞遊走アッセイに十分なニューロスフェアが存在することを確認するために、2〜3個のディッシュを準備します。
      手記：コーティング基板がないため、NPCはメディアに浮遊したままになり、これはニューロスフェアの形成に不可欠です。ディッシュをコーティングすることで、ニューロスフェアの形成を防ぐことができます。
   2. 細胞を持ち上げ、解離し、ペレット化します。細胞ペレットを2〜5 mLの予熱済み100%増殖培地に再懸濁します。 セクション1.1.1で準備した各35mm皿に100万人のNPCを皿に盛り付けます。
   3. NPCを37°Cで48〜96時間インキュベートし、NPCが凝集してニューロスフェアを形成するようにします。位相差顕微鏡のライブ定規を使用して球のサイズを評価します。ほとんどの球体が約100μm(±20μm)の直径に達するのを待ちます(図1)。小さな球体は、移行アッセイ中に完全に分散してバラバラになります。
2. ニューロスフェアマイグレーションアッセイ用プレートの調製
   1. ECM模倣ゲルアリコートを6 mLの30%膨張培地に溶解します。ECM模倣ゲル/30%膨張培地溶液を調製したら、ビヒクル、成長因子、または目的の薬物を希望の濃度で追加します
      手記：ビヒクル、薬物、および成長因子の濃度は、セクション 1.3 で 200 μL のニューロスフェアを追加するために増加させる必要があります。
   2. ECM模倣ゲル/30%膨張培地溶液(ビヒクル、成長因子、または薬剤±)1 mLを6ウェルプレートの1ウェルにプレートします。実験条件ごとに2〜3個のウェルを作成します。あるいは、35mmの皿を使用することもできます。プレートを37°Cで少なくとも30分間インキュベートします^。
      手記：このアッセイでは、ECM-mimicゲル/30%拡張培地溶液を吸引しないでください。吸引されたECM-Mimicゲルに球体をめっきすると、急速かつ過剰な移動が発生します。
3. ニューロスフィアのめっき
   1. セクション1.1で形成されたニューロスフェアを収集し、円錐形のチューブに入れます。35mmの皿を1mLの1x PBSで洗い、すべてのニューロスフェアが収集されていることを確認します。収集したニューロスフェアを100 x gで5分間スピンダウンします。
   2. ニューロスフェアを1〜3 mLの予熱済み30%拡張培地に再懸濁します。ニューロスフェアの皿1皿を採取した場合、1mLの培地を使用して球体を再懸濁します。2皿を採取した場合は、2mLの培地を添加して球体等を再懸濁します。球体が壊れないように、P-1000のみで静かにピペット
   で行ってください。
   3. 再懸濁したニューロスフェアの200μLをECM模倣ゲル/セクション1.2で作成した30%拡張溶液にプレートします。ニューロスフェアを均等に分散させるために、すべての方向に岩板を配置。プレートを37°Cで48時間インキュベートします。
   4. ECM模倣ゲル/30%増殖培地溶液を取り出し、細胞を4% PFAで固定し、細胞を1x PBS + 0.05%アジ化ナトリウムで洗浄して保持します。
4. ニューロスフェアの解析
   1. 位相差を10倍にして、ニューロスフェア全体の画像を取得し、スフィアが互いに接触していないことを確認します。ImageJソフトウェアを使用して平均移行を測定します。
   2. フリーハンドのラインツールを使用して、ニューロスフィアの外側の輪郭をトレースします。フリーハンドの線には、「直線」の線のアイコンを右クリックするとアクセスできます。マウスを使用して手動でトレースします。
   3. measure 関数を使用して、トレースの面積を計算します。[解析]タブの下にある[測定値の設定]ウィンドウで、読み出しとして[area]が選択されていることを確認します。図 2 に、青色の外側の輪郭のトレースを示します。
   4. 球体の内部セル質量をトレースし、面積を測定します。赤で内側の輪郭のトレースについては、図 2 を参照してください。ニューロスフェアの総面積から内部細胞の質量を差し引くことにより、平均移動を定量化します。
   5. 細胞が密集した内部細胞塊を示し、細胞が連続したカーペットとして移動するニューロスフェアを測定します(図2)。
   6. カーペットの外側にある細胞やニューロスフィアから分離した細胞を測定に含めないでください。外側のカーペットの測定から除外されるセル(白丸で囲まれた部分)の例については、図2を参照してください。各状態について、最低20個のニューロスフィアを分析します。

結果

図1:移動アッセイのためのニューロスフェアの選択 (A)24時間におけるニューロスフェアの代表的なフィールドの位相コントラスト画像。球体はすべて100μm未満であるため、移行アッセイでは収集されません。(B)72時間におけるニューロスフェアの代表的なフィールドの位相コントラスト画像。すべての球体は100 μm±20 μmの範囲内にあり、移行アッセイのために回収する準備ができていることを示しています。

図 2: 移行の定量化。(A)代表的なニューロスフェアの位相差画像。(B)青いアウトラインは、総ニューロスフェア面積を測定するためのトレースを表示...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049	NIMと100%拡張媒体の両方のコンポーネント
PSC神経誘導媒体:プロトコルリンク:https://goo.gl/ euub7a	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1647801	これは、ニューロベースル(NB)培地と50倍ニューラルインダクションサプリメント(NIS)で構成されるキットです。NISは、1X Neural Induction Mediumと100% Expansion Mediumの製造に使用されます
アドバンスドDMEM/F12ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒12634-010	100%拡張媒体のコンポーネント
hESC認定マトリゲル	コーニング	354277	hESC修飾細胞外マトリックス模倣ゲル(ECM-mimic gel)
6ウェルプレート	コーニング	COR-3506	NPCのメンテナンスやニューロスフェアマイグレーションアッセイに使用されるポリスチレンプレート
ヒューマンベーシックFGF-2	ペプロテック	100-18B	成長要因
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	抗生物質、NIMの成分、100%拡張および30%拡張培地