アストロサイト単離:マウス皮質アストロサイトの純粋な調製を得る方法

要約

出典:Schildge, S. et al.マウス皮質アストロサイトの分離と培養。 J. Vis. Exp.(2013年)

この動画では、新しく生まれたマウスからアストロサイトの純粋な調製物を得る方法について説明しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 混合皮質細胞の単離とプレーティング

アストロサイト培養のための混合皮質細胞単離は、P1からP4マウスの子犬を用いて行うことができます。適切なアストロサイト密度を達成するためには、T75組織培養フラスコごとに4つのマウス仔皮質を使用する必要があります。したがって、以下のプロトコルのボリュームは、4匹のマウスの子犬を使用した細胞調製物について計算されます。

1. 解剖手順を開始する前に、30 mLのアストロサイト培養培地(DMEM、高グルコース + 10%熱不活化ウシ胎児血清 + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン、表参照)を37°Cに予温し、1つのT75フラスコに20 mLのポリ-D-リジン(PDL)を50 μg/mLの濃度で細胞培養グレードの水に1時間、CO₂インキュベーターで37°Cで1時間コーティングします。
2. 解剖手順では、必要なすべての試薬と材料を準備します。手術用ハサミ、滑らかな細い鉗子、平らな先端の鉗子、ペーパータオル、ゴミ袋、70%エタノール、およびそれぞれ2mLのHBSSで満たされた氷の上に2つの解剖皿(直径3.5cm)が必要です。
3. マウスの子犬の頭と首を優しく保持し、70%エタノールをスプレーします。動物はハサミを使って斬首され、生け贄にされます。
4. 頭皮に沿って後方から前方に正中線切開を行い、頭蓋骨を明らかにします。
5. 頭蓋骨を首から鼻にかけて慎重に切ります。脳へのさらなるアクセスを可能にするために、さらに2つのカットが行われます:最初のカットは嗅球の前方に作られ、もう1つは小脳の下に配置され、頭蓋骨を頭蓋骨基部から切り離します。
6. 平らな先端の鉗子を使用して、頭蓋フラップを静かに横に反転させ、脳を取り出してHBSSで満たされた最初の解剖皿に入れます。皿を氷に戻し、4つの脳すべての収穫を続けます。
7. 解剖手順の残りの部分は、実体顕微鏡下で行われます。まず、嗅球と小脳を微細解剖鉗子を使用して除去します(図1B)。
8. 皮質を回収するには、細かい鉗子で脳の後端をつかみ、半球の間に正中線切開を行い、作成された木立に2番目の鉗子セットを挿入し、脳から皮質の板状の構造を剥がします。
9. 細かい鉗子で引っ張ることにより、皮質半球から髄膜を慎重に解剖します(図1D ')。このステップにより、髄膜細胞や線維芽細胞による最終的なアストロサイト培養の汚染を回避できます。準備した皮質半球をHBSSで満たされた2番目の皿に移し、氷に戻します。それに応じて、4つの皮質すべてで続けます。
10. 最後に、各皮質半球を鋭利な刃を使用して(約4〜8回)小さく切ります。
11. 無菌条件下で、皮質片を1本の50 mL Falconチューブに移し、HBSSを合計22.5 mLに加えます。.
12. 2.5 mLの2.5 % トリプシンを加え、組織を37°Cの水浴で30分間混合し、10分ごとに時々振って混合します。
13. 300 x gで5分間遠心分離し、皮質組織片をペレット化します。
14. デカンテーションにより上清を慎重に取り除きます。ティッシュペレットを紛失しないように、ピペットを使用して機械的に保持することができます。10 mLのアストロサイトプレーティング培地を添加し、組織片が単一細胞に解離するまで(20〜30回)10 mLのプラスチックピペットを使用して激しくピペッティングすることにより、組織を単一細胞懸濁液に解離します。アストロサイトめっき培地を用いて容量を20mLに調整します。皮質組織が単一細胞に解離していることは、血球計算盤を使用してカウントすることで証明できます。4匹のマウス仔皮質の1回の調製で、10〜15 x10⁶個の解離した単一細胞が得られるはずです。
15. T75培養フラスコからPDLを吸引し、解離した単一細胞懸濁液をプレート化し、_CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします。

2. 濃縮されたアストロサイト培養物の取得

1. 混合皮質細胞のプレーティングの2日後およびその後3日全てで培地を交換する。
2. 7〜8日後、アストロサイトがコンフルエントになり、オーバーレイするミクログリアがアストロサイト層に露出しているか、すでにアストロサイト層から分離している場合(図2)、T75フラスコをオービタルシェーカーで180rpmで30分間振とうして、ミクログリアを除去します。ミクログリアを含む上清を捨てるか、ミクログリアを培養して調べたい場合は、スピンダウンして培養のためにプレート
化します。
3. 20 mLの新鮮なアストロサイト培養培地を加え、フラスコを240 rpmで6時間振とうして、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)を除去します。OPCの中にはアストロサイト層から完全には離散しないものがありますので、OPCの混入を防ぐために、手で1分間激しく振とう続けます。上清を捨てるか、OPCを培養したい場合は、スピンダウンしてプレートに盛り付けます。
4. 残りのコンフルエントアストロサイト層をPBSで2回すすぎ、PBSを吸引し、5mLのトリプシン-EDTAを加え、37°Cの_CO2インキュベーターでインキュベートします。アストロサイトの剥離を5分ごとにチェックし、フラスコを手のひらに当ててアストロサイトの剥離を強制します(2〜3回)。
5. アストロサイトを培養フラスコから分離した後、5 mLのアストロサイト培養培地を加え、細胞を180 x gで5分間スピンし、上清を吸引し、40 mLの新鮮なアストロサイトプレーティング培地を加えます。1つのT75組織培養フラスコは、最初の細胞分裂後に約1x10⁶細胞を産出するはずです。2つのT75培養フラスコで細胞をプレート化し、CO₂インキュベーターで37°Cでインキュベートします。2〜3日ごとに媒体を交換してください。
6. 最初の分裂から12〜14日後、実験を行う24〜48時間前に、アストロサイトを適切な細胞濃度でプレーティングします。1つのT75組織培養フラスコは、2番目の細胞分裂後に約1.5〜2 x10⁶細胞を産出するはずです。

結果

図 1.出生後(P3)マウス皮質の解剖A)全脳。B)嗅球と小脳を切除した後の脳。C)皮質の板状構造を脳から剥がすことによる皮質の分離。D, D')髄膜を伴う腹側および背側部位からの皮質(黒い矢印は髄膜動脈を示す)。 E)髄膜のない皮質。スケールバー、1.5mm。

図 2.単離後の異なる時点における単離された混合皮質細胞と純粋なアストロサイト培養の形態学的概観 A) 混合皮質細胞のプレーティングの1日後。まず、アストロサイトがフラスコの底に付着し(黒い矢印)、死にかけているニューロンが上清の中にあります。 B) 混合皮質細胞のプレーティングから3...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アストロサイト培養培地
DMEM高グルコース	ライフテクノロジー	31966-021
FBSヒート不活性化	ライフテクノロジー	10082-147	最終濃度:10%
ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122	最終濃度:1%
脳組織消化のための解決策
HBSSの	ライフテクノロジー	14170-088
2.5%トリプシン	ライフテクノロジー	15090-046	最終濃度:0.25%
他
70%(vol / vol)エタノール	ロス	9065.2
ポリ-D-リジン	ミリポールA-003	A-003-E
水	PAAの	S15-012	細胞培養グレード
PBSの	PAAの	H15-002	細胞培養グレード
0.05%トリプシン-EDTA	ライフテクノロジー	〒25300-062
0.45 μm 滅菌フィルター	ザルトリウス	16555
3.5cmシャーレ	BDファルコン	353001
15mlファルコンチューブ	BDファルコン	352096
50mlファルコンチューブ	BDファルコン	352070
75 cm2 組織培養フラスコ	BDファルコン	353136
鉗子は細かい	デュモン	2-1032; 2-1033	#3c; #5
鉗子フラットチップ	KLSマーティン	12*120*11
13cm手術用ハサミ	エイスクラップ	BC-140-R
実体顕微鏡	ライカ		MZ7.5
実体顕微鏡+カメラ	ライカ		MZ16F;DFC320
マイクロスコープ+カメラ	ツァイス;カノン		プリモヴェール;パワーショットA650 IS
遠心機	エッペンドルフ	5805000.017	遠心分離機5804R
オービタルシェーカー	サーモサイエンティフィック	SHKE 4450-1CE	マックスQ 4450
ウォーターバス	ジュラボ		SW20; 37 °C

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