アストロサイト単離:マウス皮質アストロサイトの純粋な調製を得る方法

要約

出典:Schildge, S. et al.マウス皮質アストロサイトの分離と培養。 J. Vis. Exp.(2013年)

この動画では、新しく生まれたマウスからアストロサイトの純粋な調製物を得る方法について説明しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 混合皮質細胞の単離とプレーティング

アストロサイト培養のための混合皮質細胞単離は、P1からP4マウスの子犬を用いて行うことができます。適切なアストロサイト密度を達成するためには、T75組織培養フラスコごとに4つのマウス仔皮質を使用する必要があります。したがって、以下のプロトコルのボリュームは、4匹のマウスの子犬を使用した細胞調製物について計算されます。

1. 解剖手順を開始する前に、30 mLのアストロサイト培養培地(DMEM、高グルコース + 10%熱不活化ウシ胎児血清 + 1%ペニシリン/ストレプトマイシン、表参照)を37°Cに予温し、1つのT75フラスコに20 mLのポリ-D-リジン(PDL)を50 μg/mLの濃度で細胞培養グレードの水に1時間、CO₂インキュベーターで37°Cで1時間コーティングします。
2. 解剖手順では、必要なすべての試薬と材料を準備します。手術用ハサミ、滑らかな細い鉗子、平らな先端の鉗子、ペーパータオル、ゴミ袋、70%エタノール、およびそれぞれ2mLのHBSSで満たされた氷の上に2つの解剖皿(直径3.5cm)が必要です。
3. マウスの子犬の頭と首を優しく保持し、70%エタノー....

結果

図 1.出生後(P3)マウス皮質の解剖A)全脳。B)嗅球と小脳を切除した後の脳。C)皮質の板状構造を脳から剥がすことによる皮質の分離。D, D')髄膜を伴う腹側および背側部位からの皮質(黒い矢印は髄膜動脈を示す)。 E)髄膜のない皮質。スケールバー、1.5mm。

図 2.単離後の異なる時点における単離された混合皮質細胞と純粋なアストロサイト培養の形態学的概観 A) 混合皮質細胞のプレーティングの1日後。まず、アストロサイトがフラスコの底に付着し(黒い矢印)、死にかけているニューロンが上清の中にあります。 B) 混合皮質細胞のプレーティングから3.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アストロサイト培養培地
DMEM高グルコース	ライフテクノロジー	31966-021
FBSヒート不活性化	ライフテクノロジー	10082-147	最終濃度:10%
ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122	最終濃度:1%
脳組織消化のための解決策
HBSSの	ライフテクノロジー	14170-088
2.5%トリプシン	ライフテクノロジー	15090-046	最終濃度:0.25%
他
70%(vol / vol)エタノール	ロス	9065.2
ポリ-D-リジン	ミリポールA-003	A-003-E
水	PAAの	S15-012	細胞培養グレード
PBSの	PAAの	H15-002	細胞培養グレード
0.05%トリプシン-EDTA	ライフテクノロジー	〒25300-062
0.45 μm 滅菌フィルター	ザルトリウス	16555
3.5cmシャーレ	BDファルコン	353001
15mlファルコンチューブ	BDファルコン	352096
50mlファルコンチューブ	BDファルコン	352070
75 cm2 組織培養フラスコ	BDファルコン	353136
鉗子は細かい	デュモン	2-1032; 2-1033	#3c; #5
鉗子フラットチップ	KLSマーティン	12*120*11
13cm手術用ハサミ	エイスクラップ	BC-140-R
実体顕微鏡	ライカ		MZ7.5
実体顕微鏡+カメラ	ライカ		MZ16F;DFC320
マイクロスコープ+カメラ	ツァイス;カノン		プリモヴェール;パワーショットA650 IS
遠心機	エッペンドルフ	5805000.017	遠心分離機5804R
オービタルシェーカー	サーモサイエンティフィック	SHKE 4450-1CE	マックスQ 4450
ウォーターバス	ジュラボ		SW20; 37 °C

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