ラット脳微小血管からの内皮細胞培養:ラット脳の微小血管から内皮細胞を単離および培養する手順

要約

出典:Molino, Y. et al. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-Brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp.(2014年)

このビデオでは、密度勾配遠心分離と酵素消化メホッドの組み合わせを使用して、ラットの脳から微小血管を分離する様子を紹介しています。単離された微小血管は、コラーゲンとフィブロネクチンマトリックスでプレコートされた培養フラスコで培養し、内皮細胞コロニーを得ることができます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ラット脳微小血管の分離

1. 各調製物および1人の実験者に対して、5週齢のWistarラット3匹を使用します。
2. 第1週の月曜日に、IV型コラーゲンとフィブロネクチンを滅菌培養水(T75あたり10 ml)で1 μg/cm²でコーティングして、2つのT75フラスコを調製します。マイクロベッセル播種まで37°Cで接着します。
3. 最初の週の水曜日の朝、眠気、姿勢の喪失、呼吸の中断を誘発するために、CO₂ の増加フラックス下でラットを安楽死させ、その後、頸部脱臼を引き起こします。ヘッドに70%エタノールをスプレーします。ハサミで頭を切り、層流フードの下の乾燥シャーレに移します。
4. 小脳と視神経なしで頭蓋骨から脳を取り出し、氷で冷却し、冷たい解剖緩衝液(HBSSに1%BSA、ペニシリン100ユニット/ ml、ストレプトマイシン100μg / mlを補充)で満たされたシャーレに移します。
5. 脳を半分に切って2つの大脳半球を分離し、中脳を前脳から分離します。前脳を解剖バッファー付きの氷上のきれいなペトリ皿に移します。
6. 新しいペトリ皿にいくつかの半球を取り、冷解剖バッファーを使用して、N°5湾曲した鉗子を備えた実体顕微鏡で前脳から髄膜を慎重に除去します。次に、脳の内部をきれいにしてミエリンの羽毛布団を取り除き、皮質の殻を取得します。これらのステップは、組織の保存と細胞の生存のために2時間以上かかるべきではありません。
7. 皮質を 3 つの脳から 7 mL の 7 mL の dounce ホモジナイザーで 6 mL の冷解剖バッファーに解離し、クリアランスの異なる 2 本の乳棒 (71 μm に続いて 20 μm) をそれぞれ 10 回の上下ストロークで行います。
8. 懸濁液を分割して、50 mLのFalconチューブ1 mLに1つの皮質に相当するものを取得し、RTで1,000 x gで5分間遠心分離します。
9. コラゲナーゼ/ディスパーゼ(60 μg/mL–0.3 U/mL)、DNase I型(35 μg/mL–20 K units/mL)、およびゲンタマイシン(50 μg/mL)の混合物を含む酵素溶液 1 mL で、1 皮質の懸濁液をシェーカーで 37 °C で 30 分間消化します。
10. 1 cortex の 1 mL 消化物を 10 mL の 25 % BSA/HBSS 1X と混合し、密度依存的な遠心分離により 3,600 x g で RT で 15 分間分離します。上部椎間板(ミエリンおよび脳実質)と上清を清潔な 50 mL の Falcon チューブに慎重に移し、遠心分離を繰り返します。得られたペレットには脳の微小血管が入っており、4°Cに保ちます。
11. 上部ディスクと上清を慎重に捨てます。得られた両方のペレットに脳の微小血管を1 mLの冷たいHBSS 1Xで再懸濁し、きれいな50 mLのFalconチューブに移します。
12. 20 mLの冷たいHBSS 1Xを加えてマイクロ容器を洗浄し、1,000 x gで5分間遠心分離します。
13. さらに、ステップ1.9で説明したのと同じ酵素溶液1 mLで1 mLの皮質から微小血管を消化し、シェーカーで37°Cで1時間
過ごします。
14. 次に、3つの皮質のそれぞれから消化された微小血管を1本のチューブに混合し、さらに2本の50mLファルコンチューブに分離して、チューブあたり1.5皮質に相当する微小血管から抽出した微小血管を得る。30 mLの冷解剖バッファーを加え、1,000 x gで室温で5分間遠心分離します。
15. 20%ウシ血小板欠血漿由来血清、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF、2 ng/mL)、ヘパリン(100 μg/mL)、ゲンタマイシン(50 μg/mL)およびHEPES(2.5 mM)を添加したDMEM/F12 10 mLにマイクロ血管ペレットを再懸濁します。ピューロマイシンを4 μg/mLで添加した名前付き内皮細胞培地(ECM)です。
16. インキュベーターからコーティングされた2つのT75フラスコを取り出し、余分なコーティングを吸引し、各チューブの微小血管を1つのT75フラスコ(T75フラスコあたり1.5皮質から抽出された微小血管)にプレートします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ胎児血清	インビトゲン	〒10270-098	-20°C/1年間
BSAフラクションV低エンドトキシン	PAAの	K45-011-500グラム	4 °C
ペニシリン-ストレプトマイシン	インビトゲン	15140-122	-20°C
T75フラスコ	ベクトン・ディキンソン・ファルコン	353135
HEPESバッファー(1 M)	インビトゲン	15630から056	4 °C / 1年間
IV型コラーゲンマウス(10 x 1 mg)	ベクトン・ディキンソン	356233	-20°C/1ヶ月
フィブロネクチンヒューメイン血漿(5 mg)	ベクトン・ディキンソン	356008	-20°C/1ヶ月
バンナススプリングハサミ、ストレート(9 cm)	ファインサイエンスツール	91500から09
はさみ、ストレート(9 cm)	ファインサイエンスツール	14568から09
フォーセプスデュモン#5/45(11 cm)	ファインサイエンスツール	11251から35
グレーフ鉗子、先端幅0.8 mm	ファインサイエンスツール	11050から10
グレーフ鉗子、カーブ先端幅0.8 mm	ファインサイエンスツール	11051から10
コラゲナーゼ/ディスパーゼミックス(2 x 5 mg)	ロシュ・ダイアグノスティック	05 401 054 001	-20°C/3ヶ月
DNase I(100 mg / 569 KU / mg)	シグマ・アルドリッチ	DN25-100 mg	-20°C/1年間
ゲンタマイシン(10mg / ml)	インビトゲン	15710-049	4 °C / 1年間
DMEM/F12	インビトゲン	31331-028	4 °C
血小板乏血漿由来のウシ血清(500ml)	クリニサイエンス	BT-214-100	-20°C/1年間
bFGF(10μg)	インビトゲン	13256から029	-20°C/6ヶ月
ブタ粘膜からのヘパリンNa塩グレードI	シグマ・アルドリッチ	H3149-100KUさん	4 °C / 1年間
ピューロマイシン	シグマ・アルドリッチ	P8833-10 mg	-20°C/6ヶ月

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