血液脳腫瘍関門またはBBTBモデル:腫瘍への治療薬の送達を評価するための血液脳関門またはBBBモデルの適応

要約

出典: Le Joncour, V. et al. Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、血液脳腫瘍関門を模倣したin vitroモデルを確立するための包括的なプロトコルについて説明します。このモデルは、脳腫瘍の治療のための治療薬の送達を理解するのに有望です。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. BBTB Mimicsの設立

>注:細胞培養培地とサプリメントは、材料の表に詳述されています。

1. アストロサイトの調製
   手記： 以下の容量は、10 cmのシャーレまたはT75細胞培養フラスコに適しています。
   1. 滅菌細胞培養フードの下で、培養したアストロサイトを5 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で慎重に洗浄します。真空ポンプを使用してPBSを静かに廃棄し、2 mLの細胞解離試薬を5分間(37°Cで、材料表を参照)加えて細胞を剥離します。顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。細胞へのストレスを制限するために、インキュベーションは5分を超えないようにしてください。
   2. 10 mLの滅菌完全アストロサイト細胞培養培地(ABM+)を容器に添加して、細胞解離試薬の活性を阻害します。滅菌血清ピペットを使用して、分離した細胞を容器から滅菌済みの15 mLチューブに移します。細胞懸濁液を室温(RT)で250 rcf(加速:9 rcf/s、減速:5 rcf/s)で3分間遠心分離します。
   3. その間、インサートを準備します(材料の表を参照):滅菌鉗子を使用して、脳側を上にしてインサートを置きます(図1A)滅菌6ウェルプレート(図1B)の蓋に。プロセス中にプレートをインサートに触れたり動かしたりせずに、プレートをインサートに逆さまに置くことができることを事前に確認してください.
      注:インサートを適切に配置することで、アストロサイト懸濁液をメンブレンとウェルの底の間に閉じ込めることができます。
   4. 遠心分離したら、細胞懸濁液から上清を慎重に捨てます。アストロサイトペレットをチューブの壁に5倍まで穏やかに再懸濁することにより、アストロサイトペレットをABM+の1 mLに再懸濁します。細胞へのストレスを制限するために、細胞の過度のピペッティングを避けてください。細胞をカウントし、細胞懸濁液密度を400 μL ABM+/インサート中の⁵細胞 1.5 x 10 に調整します。
   5. 細胞懸濁液をインサートのメンブレン(図1B)の脳側の中央に置き、非常に慎重に、滅菌ピペットチップで毛細管現象を使用して広げます。メンブレンは特に壊れやすいため、直接接触することは避けてください。
   6. インサートのブレイン側を上にしたまま、6ウェルプレートをインサートに戻します。これにより、細胞懸濁液がメンブレンと実際のウェルの底部との間に確実に閉じ込められます(図1C)。細胞懸濁液中の気泡は、膜上の星状細胞の均一な広がりを防ぐため、避けてください。
   7. プレートとインサートを脳側を上にしてインキュベーター(37°C、5%_CO2)に置き、細胞接着を最小2時間(マウスの不死化アストロサイト)から最大6時間(ヒト初代アストロサイト)可能にします
      注:インサートは逆さまに維持されているため、顕微鏡下で細胞接着を視覚化することはできません。したがって、別の通常の細胞培養容器に播種し、容器内の細胞接着を経時的に制御することをお勧めします。メンブレンが損傷すると結果が信頼できなくなるため、メンブレンの慎重な操作は必須です。
   8. インキュベーション時間の終わりに、播種エリアの外部に細胞懸濁液が漏れていないことを確認し、インサートが漏れている場合はチップを廃棄します。6ウェルプレートを通常の位置に戻し、血液側が上になっているインサートを使用します(図1A)。各ウェルに2.6 mLのABM+を加えます。2.5 mLの完全アストロサイト培地を各インサートに注ぎ、プレートをインキュベーター(37°C、5% CO₂)に置きます。

>2. 内皮細胞の調製

>注:マウス脳微小血管内皮細胞(bEND3)の場合、実験当日に最適なタイトジャンクションタンパク質発現を引き起こす最大の細胞間接触を確保するために、細胞は100%のコンフルエンスに達する必要があります。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HuAR2T)には当てはまらず、これらの細胞のタイトジャンクションタンパク質発現にはアストロサイトの存在が必要です。

1. 細胞解離のためのアストロサイトについて前述したように進行します。遠心分離したら、上清を慎重に捨てます。チューブの壁に細胞懸濁液を最大5倍までゆっくりとピペッティングすることにより、1 mLの完全内皮細胞培養培地(EBM+)に内皮細胞ペレットを再懸濁します。細胞へのストレスを制限するために、細胞の過度のピペッティングは避けてください。細胞をカウントし、血清を含まない内皮細胞培養培地(EBM-)および血管内皮増殖因子-A(VEGF-A)の挿入物2.5mL/インサート中の細胞懸濁液密度を2 x 10⁵細胞に調整します。
2. インサートが入ったプレートを取り出し、血液側から培地を慎重に捨て、2.5mLの内皮細胞懸濁液と交換します。プレートをインキュベーターに戻し(37°C、5%CO₂)、内皮細胞がメンブレンに付着するまで一晩放置します。
3. 翌日、予熱した3 mLの予熱済み無血清アストロサイト培地(ABM-)を各ウェルに移して、滅菌6ウェルプレートを調製します。滅菌鉗子でインサートを取り扱うことにより、血液側から内皮完全培地を慎重に廃棄し、ABM-を含む新しいプレートにインサートを置き、2.5mLのEBM-.
   を追加します 手記： EBM-の使用は、内皮バリアの確立にとって重要です。
4. インキュベーター(37°C、5%CO₂)にインサートを放置し、物理的障害と温度変化を最小限に抑えて5日間放置すると、内皮基底膜の産生、内皮細胞との星状細胞の接触、そして最終的にはBBTB模倣形成が可能になります。神経膠腫細胞培養に移管した日に培地を交換してください。

3. 神経膠腫細胞の調製

>注:ここでは患者由来の膠芽腫球が使用されていますが、次のプロトコルは、U-87MGなどの市販の付着性膠芽腫細胞に容易に適合させることができます。

1. 必要に応じて、免疫蛍光イメージングのために、2 mLのポリ-D-リジン(0.01%)を含む6ウェルプレートに、ウェルあたり最大4つの丸い滅菌ホウケイ酸カバースリップ(ø 0.9 cm)を配置します。室温で30分間インキュベートします。
2. その間、滅菌血清学的ピペットを使用して、腫瘍球を細胞培養容器から15mL滅菌チューブに慎重に移します。腫瘍球体を250rcfで3分間遠心分離します。
3. 上清を捨て、球体を1 mLのbFGF/EGFフリー(GBM-)神経膠腫細胞培地に穏やかに再懸濁し、細胞をカウントします。GBM-で細胞密度を約10⁴球/mL(10⁵細胞/mL)に調整します。
4. ポリ-D-リジンをウェルから廃棄し、滅菌PBSで3回すすいでください。プレートに3 mL/ウェルの腫瘍スフェロイド懸濁液を播種し、BBB模倣物を含むインサートを腫瘍細胞懸濁液に移します。
アッセイの
5. 血液側と脳腫瘍側との間の平衡を保つために、一晩(5%_CO2で37°C)インキュベートします。翌日、血液側の培地を、目的の分子/薬物/ナノ粒子を添加したEBM-に置き換えます。サンプルは、前のセクションで説明したように、直接定量のために経時的に収集されます。細胞は、蛍光イメージングのために正確な時点で固定されます。

結果

図1:血液脳腫瘍関門(BBTB)モデルの説明。(A)異なる細胞型の位置の概略図。(B)6ウェルプレートカバーへのインサート配置と、インサートのメンブレンの脳側にあるアストロサイトの播種技術の図。(C)アストロサイトの接着を可能にする6ウェルプレートの配置の図。(D)タイトジャンクションタンパク質zonula occludens-1(ZO-1、上段、赤)およびクローディン-5(下段、緑)の免疫蛍光顕微鏡写真。タンパク質の発現は、BBTBの血液側のみで単一培養(左列)またはマウス不死化HIFkoアストロサイト(右列)で培養したマウス脳微小血管内皮細胞(bEND3)と比較されます。細胞核をDAPI(青)で対比染色します。(E)BBTBの脳側で培養されたHIFkoアストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(G...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞
bエンド3	ATCCの	CRL-2299	培養方法:DMEM(1g/Lグルコース)に10% FBS-5 mL L-グルタミンと5 mLペニシリン/ストレプトマイシンを添加
HIFko不死化マウスアストロサイト	Dr. Gabriele Bergers研究室で分離	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	培養方法:BME-1に5%FBS-5 mL、1 M HEPES-5 mL、100 mMピルビン酸ナトリウム、3 g、D-グルコース、ペニシリン/ストレプトマイシン5 mLを添加
HuAR2T(フアルテッセン)	Dr. Dagmar Wirth研究室で分離	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	培養場所:EBM-2 with SupplementMix normal human primary astrocytes Lonza CC-2565 培養場所:ABM with SingleQuots
材料と試薬
100 mm x17 mm ディッシュ ナンクロン デルタ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	150350
10 mL血清ピペット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	170361
15 mLコニカル滅菌ポリプロピレン遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	339650
ABM基礎ミディアム500 mL	ロンザ	CC-3187	初代ヒトアストロサイト用。ABM+:サプリメントミックスからのすべての添加物が含まれています。ABM-:rhEGFとFBSを除くすべての添加剤
Accutase細胞剥離ソリューション	コーニング	25-058-CIの
AGM SingleQuotsサプリメントと成長因子	ロンザ	CC-4123
B27サプリメント	ギブコ	17504-044	GBM +と-mediumの両方
ベイサルミディアムイーグル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21010046	BME-1
Corning Costar TC処理6ウェルプレート	シグマ・アルドリッチ	CLS3506
Corning Transwell ポリエステル膜細胞培養インサート	シグマ・アルドリッチ	CLS3452
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8270	培地に加える前に、50 mLのBME-1と滅菌フィルターに溶解
ダルベッコのモディファイドイーグルのミディアム/ニュートリエントF-12ハム	ギブコ	〒21331-020	私たちの研究室で分離された患者由来の球体の培養に特有のもの。他の神経膠腫細胞株では異なる場合があります
EBM-2成長培地サプリメントミックス	プロモセル	C-39216	EBM+:サプリメントミックスからのすべての添加物が含まれています。EBM-:VEGF-AとFBSを除くすべての添加剤
内皮基礎培地2(EBM-2)	プロモセル	ハ-22211	EBM+:サプリメントミックスからのすべての添加物が含まれています。EBM-:VEGF-AとFBSを除くすべての添加剤
ウシ胎児血清(FBS)、認定、熱不活化、EU承認の南アメリカ原産	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10500056
フルオレセインナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	F6377
Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート	シグマ・アルドリッチ	グライナー655090	ブラックポリスチレンウェルフラットボトム(マイクロクリアボトム付き)
Menzel-Gläser0.9cm丸型ホウケイ酸カバースリップ	サーモサイエンティフィック	10313573
PBSタブレット	メディカゴ	09-9400-100	dH2O1リットルにつき1錠、その後、オートクレーブ滅菌により溶液を滅菌する
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P6407
組換えヒトEGF	ペプロテック	GMP100-15	GBM+メディアの場合
組換えヒトFGF-塩基性(154 a.a.)	ペプロテック	100-18B	GBM+メディアの場合

の します 地 (代表) 型