ゼブラフィッシュ幼生からの脳細胞単離:ゼブラフィッシュ脳組織から無傷のニューロン、マクロファージ、およびミクログリアを得る技術

要約

出典:Mazzolini, J. et al. Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、ゼブラフィッシュの幼生の脳からニューロン、マクロファージ、ミクログリアを分離し、脳組織を機械的に破壊する手順を説明しています。精製された細胞集団は、さらにゲノム解析に使用することができます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 均質化

>注:すべてのステップは4°Cで実行されます。

1. 200 μM PTUで処理した50 mLのE3胚培地に50匹の幼虫が入った90 mmシャーレに1.5 mLのトリカイン(15 mM)を加えて、それらを終末麻酔します。
   1. 麻酔をかけた幼虫10匹をペトリ皿から3mLのパスツールプラスチックバルクピペットで吸い上げます。
   2. 麻酔をかけた幼虫を10×10で、氷のように冷たいE3胚培地+トリカインで満たされた55mmのシャーレに移します。
   3. 実体顕微鏡で、10匹の幼虫をペトリ皿の中央に揃えます。次に、外科用マイクロハサミを使用して、卵黄嚢の上の幼虫の頭を横断します(頭が浮かぶのを避けるために水泳用膀胱は除外します)。
   4. 3mLのパスツールプラスチックバルクピペットでペトリ皿から頭を吸い上げます。すべてのヘッドがピペットチップ内に集まるまで待ってから、1 mLの氷冷培地Aを含むガラスホモジナイザーに移します(培地AのE3 +トリカイン希釈を減らすために最小限の容量で移します)。ガラスホモジナイザーを氷の上に保ちます。実験条件ごとに1つのホモジナイザーを使用します。
   5. 氷のように冷たいE3 +トリカインが入った小さなペトリ皿を30分ごとに新しいものと交換して、冷たいE3 +トリカイン培地で切断が行われるようにします。
   6. 色が退色し始めたら、ガラスホモジナイザーの氷冷したメディアAを交換します.
      注:培地Aの希釈は、温度変化により頭部組織を変化させる可能性があります。
   7. すべてのヘッドが収集されたら(600ヘッド/状態)、ガラスホモジナイザーから最大量のメディアAを取り出し、1mLの新鮮な氷冷メディアAと交換します。
   8. 氷の上のタイトなガラスホモジナイザーで脳組織を破壊します。40ラウンドの破砕とターンを3〜5 dpfの幼虫に、50〜7 dpfの幼虫と8 dpfの幼虫を回転させます。
2. 細胞懸濁液(1 mL培地A/200ヘッド)に2 mLの培地Aを添加すると、細胞が希釈され、ミエリンとの凝集が減少し、密度勾配培地での遠心分離中の分離が容易になります。
   1. 細胞凝集を排除するには、氷上に保持された冷たい50 mLファルコンチューブの上に置いた40 μmの細胞ストレーナーに細胞懸濁液を通します。この操作を 3 回繰り返します。
   2. 1 mLの細胞懸濁液を冷たい1.5 mLチューブに移し、300 gで4°Cで10分間遠心します。
   3. 10mLシリンジ+針23G x 1インチを使用して上清を取り除きます。.
3. 0.5 mLの氷冷DPBS 1xで穏やかに重ね合わせた氷冷22%密度勾配培地1 mLで細胞ペレットを再懸濁します(混合しないでください、両方の溶液間に間相が見られます)。
   1. ブレーキなしで950gのスピンチューブを使用し、4°Cで30分間ゆっくりと加速します.
      注:このステップでは、DPBS 1xおよび22%密度勾配培地の中間期でミエリンを隔離することにより、ミエリンを他の細胞から分離しますが、細胞はチューブの底でペレット化します。ミエリンの除去は、細胞濃度が高すぎない場合に効率的です。
   2. 10 mLシリンジ+ニードル23G x 1インチを使用して、DPBS、密度勾配培地、およびそれらの間期にトラップされたミエリンの最大値を廃棄します。
   3. 0.5 mLの培地A + 2%の正常ヤギ血清(NGS)で細胞を洗浄し、チューブを300 gで4°Cで10分間遠心します。
   4. 上清を最大限廃棄し、同じ実験条件のすべての細胞ペレットを1 mLの培地A + 2% NGSにプールします。
4. 目的の細胞がmpeg1:eGFP由来の蛍光タンパク質様マクロファージ/ミクログリアを発現するか、NBT:DsRedトランスジェニックフィッシュ由来のニューロンを発現する場合は、細胞懸濁液を35 μmの細胞ストレーナーキャップに通し、光から保護された氷上の冷たい5 mL FACSチューブに移します
   注:あるいは、ミクログリアの免疫染色を行うこともできます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-フェニル2-チオ尿素(PTU)	シグマ	P7629
ヘペス	ギブコ	15630から056
D-グルコース	シグマ	G8644-100ミリリットル
HBSSの1X	ギブコ	14170-088
パーコール	GEヘルスケア	〒17-0891-02
HBSSの10X	ギブコ	14180-046
DPBSの1X	ギブコ	14190から094
トリカイン(MS222)	シグマ	A5040 (英語)
ステリリン標準90mmシャーレ	サーモフィッシャー	101VIRR(英語
外科用マイクロハサミ	ファインサイエンスツール	15000-00
3 mLパスツールプラスチックバルクピペット	SLSの	PIP4206
ガラス製ホモジナイザー	ウィートン	357538
ステリン標準55mmシャーレ	サーモフィッシャー	P55Vの
パーコール	GEヘルスケア	〒17-0891-02
40 μmセルストレーナー	隼	352340
50mlポリプロピレンコニカルチューブ	隼	352070
遠心機	エッペンドルフ	5804 R
正常なヤギ血清(NGS)	細胞シグナル伝達	5425Sの
35 μmセルストレーナーキャップ	BDの	352235

型 ) さん