免疫染色結合型細胞ソーティングによるミクログリアの単離:蛍光活性化細胞ソーティングを用いたゼブラフィッシュ脳細胞からのミクログリアの単離法

Abstract

出典:Mazzolini, J. et al. ゼブラフィッシュの幼虫の脳からのニューロン、マクロファージ、ミクログリアの単離とRNA抽出。 J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、免疫染色共役細胞ソーティングによりゼブラフィッシュのミクログリア細胞を単離しています。単離されたミクログリアは、脳の病理におけるそれらの役割を理解するために、下流の実験で使用することができます。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ミクログリア免疫染色

>注:すべてのステップは4°Cで実行されます。

1. 脳培養細胞から得られた細胞ペレットを、0.3 mLの培地A + 2%正常ヤギ血清またはNGSで再懸濁します。1.5 mLチューブ×3本に分けて、1本目は未染色細胞用で目的細胞の自家蛍光を測定し、2本目は二次抗体(1/200)で二次抗体のミクログリアへの非特異的結合を測定し、3本目は試験用(4C4マウスモノクローナル抗体(ミクログリア特異的)(1/20)+二次抗体(1/200))に分けます。
   1. 低エンドトキシン、アジドフリー(LEAF)を1%で細胞(すべてのチューブ)に添加して、免疫グロブリンのFcドメインとのCD16/CD32相互作用をブロックします。細胞を10分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに攪拌します。
   2. 4C4抗体(1/20)を細胞(チューブ3)に加え、10分ごとに穏やかに撹拌しながら30分間インキュベー
   トします。
   3. チューブを300 gで4°Cで10分間遠心し、上清を捨てます。
   4. 0.5 mLの培地A + 2% NGSで1回洗浄し、次いでチューブを300 x gで4°Cで10分間遠心します。
   5. 細胞ペレットを0.5 mLの培地A + 2% NGSで再懸濁し、細胞をLEAFと1%で10分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに攪拌します。
   6. 二次抗体(1/200)を細胞(チューブ2および3)に添加します。10分ごとに穏やかに攪拌し、光を保護しながら、細胞を30分間インキュベートします。
   7. チューブを300 gで4°Cで10分間遠心し、上清を捨てます。
   8. 0.5 mLの培地A + 2% NGSで2回洗浄し、次に細胞ペレットを1 mLの培地A + 2% NGSで再懸濁します。
2. 細胞懸濁液を35 μmの細胞ストレーナーキャップに通し、光から保護された氷上の冷たい5 mL蛍光活性化セルソーティングまたはFACSチューブに移します。

2. セルソーティング (FACS)

>注:すべての手順を4°Cで実行します。

1. FACS.
   を使用して、ニューロン、マクロファージ/ミクログリア、およびミクログリアを選別します。 注:この手順は通常、FACS施設のスタッフによって実行され、設定は使用する機器の種類によって異なります。
   1. 各FACSチューブに1 μg/mLの濃度のDAPIを添加し、死細胞を標識します。
   2. FACSを設定し、すべての脳細胞からニューロン、マクロファージ/ミクログリア、またはミクログリアを選別します。細胞をデブリから分離し、そのサイズと粒度の関数で、前方散乱と側方散乱によって単一細胞をゲートします。生細胞からDAPIラベリングにより死細胞を除外します。ニューロン、マクロファージ/ミクログリア、またはミクログリアをそれぞれの陽性染色により同定します。
2. 氷上に1 mLの氷冷培地A + 2% NGSを入れた1.5 mLチューブに細胞を回収します。細胞の種類ごとに異なるチューブを使用してください。
   1. チューブを300 x gで4°Cで10分間スピンし、上清を捨てます。
   2. 0.5 mLの培地Aで一度洗浄し、最大量の上清を捨てます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ヘペス	ギブコ	15630から056
D-グルコース	シグマ	G8644-100ミリリットル
HBSSの1X	ギブコ	14170-088
正常なヤギ血清(NGS)	細胞シグナル伝達	5425Sの
35 μmセルストレーナーキャップ	BDの	352235
FACSチューブ	BDの	352063
低エンドトキシン、アジ化物フリー(LEAF)	バイオレジェンド	101321
Alexa Fluor 647 ヤギ抗マウス IgG (H+L)	ライフテクノロジー	A11008(英語)
アンチ4C4	提供:Catherina Becker(エジンバラ大学)
FACS選別機 FACSAria II	BDの	QMRI、FACS施設