Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro:特定の遺伝子発現のノックダウンのためのレンチウイルスベースのshRNA発現システムのiHSPCへのデリバリー

要約

出典:Hsiao, Y. L., et al. 造血幹および前駆細胞株In vitroにおけるショートヘアピンRNA媒介遺伝子ノックダウンによる樹状細胞発生の研究。 J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオでは、shRNAレンチウイルスベクターの形質導入を行い、不死化造血幹細胞および前駆細胞(iHSPC)で安定したノックダウン細胞株を得る方法を示します。

プロトコル

1. 不死化造血幹細胞および前駆細胞株(iHSPC)の調製

1. 100 ng/mL FLおよび1 μM β-エストラジオールを含む完全なRPMI 1640培地でiHSPC細胞株を維持します。
2. 3日ごとに1:10の割合で細胞を継代します.
   手記：10%ウシ胎児血清(FBS)、5 ^x10-5 M β-メルカプトエタノール、および10 μg/mLゲンタマイシンを添加して、完全なRPMI 1640培地を調製します。組換えマウスFLも市販されています。

2. レンチウイルス形質導入

1. 100 ng/mL FL、1 μM β-エストラジオール、8 μg/mL ポリブレンを含む完全培地 1 mL 中の 12 ウェルプレートに 1 x 10⁵ 細胞/ウェルの密度で iHSPC をプレート
   手記：ポリブレンの濃度は細胞の種類によって異なり、通常は4〜8μg/mLの範囲です。
2. shRNAを担持レンチウイルスを各ウェルに100.
   の感染多重度(MOI)で添加します 手記：レンチウイルスベクターは、ピューロマイシン選択マーカーを付加したpLKO.1-Puroです(図1)。LacZ、Tcf4、Id2に対するshRNAの標的配列は、それぞれ材料表に記載されています。MOIは、感染中に細胞ごとに追加されるビリオンの数によって定義されます。
   
3. プレートを1,100 x gで37°Cで90分間回転させます。
4. 感染細胞を含むプレートをインキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします
   手記：細胞がポリブレンに感受性がある場合は、スピン感染後にポリブレンを含まない完全な培地で細胞をリフレッシュしてください。
5. 感染後24時間後に、100 ng/mL FLおよび1 μM β-エストラジオールを含む完全培地で細胞をリフレッシュします。
6. 培地に6 μg/mLのピューロマイシンを加えて、さらに24時間後に感染細胞を選択します
   手記：形質導入されたレンチウイルスベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子を発現するのに通常48時間かかります。ピューロマイシンの濃度が各細胞株に対して最適化されていることを確認してください。
7. 100 ng/mL FL、1 μM β-エストラジオール、および 6 μg/mL ピューロマイシンを含む選択培地を 3 日ごとにリフレッシュし、細胞を少なくとも 1 週間維持して、安定的に形質導入した iHSPC 細胞を増殖させます。
   手記：ピューロマイシンの選択は通常48時間後に効果を発揮し、選択の期間は細胞の種類によって異なります。

結果

図1:レンチウイルスベクターpLKO.1-Puroの組成物。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5mLマイクロチューブ	エクストラジーン	チューブ-170-C
12ウェル組織培養処理プレート	隼	353043
ウシ胎児血清(FBS)	コーニング	35-010-CV
RPMI 1640 ミディアム	ギブコ	11875-085
β-エストラジオール	シグマ・アルドリッチ	E2758-250MG
β-メルカプトエタノール(β-ME)	シグマ・アルドリッチ	M6250
Flt3リガンド(FL)	自家製
ポリブレン	シグマ・アルドリッチ	TR-1003-G
ピューロマイシン	インビボゲン	アント-PR-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	RNAiコンソーシアム(TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	RNAiコンソーシアム(TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	RNAiコンソーシアム(TRC)

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