オールインワンCRISPRゲノム編集:CRISPR-Cas9システムを用いた培養細胞における相同性指向修復ベース遺伝子ノックイン法

要約

出典:Zhang, L. et al, Gene Knock-in CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines. J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、Cas9とsgRNAが単一のプラスミドコンストラクトとして細胞に提供される培養細胞でのオールインワンCRISPR-Cas9ベースのゲノム編集を実演します。CRISPR-Cas9システムと挿入する目的の遺伝子をエレクトロポレーション技術によって細胞に導入し、遺伝子編集を成功させました。

プロトコル

1. マクロファージおよびT細胞株のエレクトロポレーション

1. エレクトロポレーション用の細胞培養物の準備
   1. Jurkat T細胞の完全な増殖培地として、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640を準備します。RAW264.7マクロファージを培養するために、10%FBSを含むダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を調製します。すべての完全増殖培地に100 U/mLペニシリンおよび100 μg/mLストレプトマイシン(Pen/Strep)を補充します(ただし、細胞選別前のトランスフェクション後のインキュベーションに使用される培地を除く)。
   2. RAW264.7およびJurkat T細胞の継代培養は、サプライヤーの指示に従って行ってください(材料表参照)。RAW264.7細胞を継代培養する場合は、トリプシン-EDTA溶液(0.25%)を使用して細胞を剥離します。RAW264.7およびJurkat細胞の凍結保存培地として、10%(v/v)DMSOを添加したFBSを使用してください。
   3. RAW264.7マクロファージの場合は250 × gで5分間、Jurkat T細胞の場合は90 × gで8分間細胞を回収します。次に、5〜10 mLの1× DPBS(Ca²⁺またはMg²⁺イオンを含まない)で洗浄します。DPBSを取り外します。
   4. 2 mLの1× DPBSを使用して細胞ペレットを再懸濁します。10 μL の細胞を使用し、等量の 0.2% トリパンブルーと混合して、細胞数と生存率を推定します。
      手記：トランスフェクション当日に細胞培養の生存率が>90%であることを確認してください。
   5. 1回のノックイン実験では、10 μLのヌクレオフェクションチップを使用してエレクトロポレーションを5回繰り返します。2.0 × 106個の細胞に必要な容量を計算し、遠心分離により細胞をペレット化します。ステップ1.1.2.
      で説明されているように、細胞ペレットを1× DPBSで再度洗浄します 手記：10 μLのヌクレオフェクションチップを使用する場合、エレクトロポレーションごとに4.0×10⁵個の細胞が必要です。したがって、1回のノックイン実験に対して、少なくとも2.0×10個の⁶個の細胞を調製します。
   6. ペン/連鎖球菌を含まないウェルあたり0.5 mLの完全な増殖培地(ステップ1.1.1で調製)を入れた24ウェルプレートを調製し、37°Cのインキュベーターで予温します。

2. CRISPR/Cas9成分と標的ベクトルのエレクトロポレーション

1. エレクトロポレーションシステムの電源を入れます。RAW264.7マクロファージの場合は1,400 V/20 ms/2パルス、Jurkat T細胞の場合は1350 V/20 ms/2パルスのように最適化されたエレクトロポレーションパラメータを使用します。
2. ピペッティングによるサンプル損失を考慮して、滅菌済みの 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 55 μL のエレクトロポレーション混合物を調製し、各 CRISPR/Cas9 ベクター (mRosa26 遺伝子座ノックインの場合は pDsR-mR26-sg1 および pDsR-mR26-sg2、hROSA26 遺伝子座の場合は pDsR-hR26-sg1 および pDsR-hR26-sg2)、線形化されたターゲティングベクター (mRosa26 および hROSA26 の場合は pKR26-POI-iBFP または pKhR26-POI-iBFP) 2.5 μg を含むノックイン、EcoRIまたはBamHIによって線形化)、および再懸濁バッファーR.
   手記：時間を節約するために、遠心分離中にエレクトロポレーション混合物を調製することができます(ステップ1.1.5)。
3. ステップ 1.2.2 の 55 μL エレクトロポレーション混合物に 2.0 × 10^{個の 6} 細胞 (ステップ 1.1.5 で調製) を再懸濁します。
4. ステップ 1.2.3 のセル/エレクトロポレーション混合物を、ピペット付きの 10 μL ヌクレオフェクションチップを使用して吸引します。
   手記：ピペッティング中は、エレクトロポレーションの失敗の原因となる可能性のある気泡の持ち込みを避けてください。
5. エレクトロポレーションキットから3 mLのバッファーEを充填したチューブにサンプルを加えます。
6. ステップ1.2.1で説明したように、2つの細胞タイプのエレクトロポレーションパラメータを適用します。
7. ステップ1.1.6で予め加温した培地を使用して、サンプルを24ウェルプレートの1つのウェルに移します。
8. 他の 4 回の繰り返し、およびターゲティングベクターのみと CRISPR 発現ベクターのみのコントロールについて、手順 1.2.4 から 1.2.7 を繰り返します。.
   手記：別の細胞タイプ/プラスミドDNAに切り替える場合は、ヌクレオフェクションチップとチューブを交換してください。
9. トランスフェクションした細胞を48〜72時間培養して、エレクトロポレーション後の回復とCRISPR/Cas9成分の発現を、フローサイトメトリー分析または蛍光活性化セルソーティング(FACS)の前に行います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンピシリン、ナトリウム塩	MPバイオメディカル	194526
セロメータミニ自動セルカウンター	ネクセロムバイオサイエンス
DPBS(10倍)、カルシウム、マグネシウムなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14200075
高グルコースのダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)	ハイクローン	01 SH30022月
ファルコン5mlポリスチレン丸底試験管	BDバイオサイエンス	352003
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10099141
ジャーカット	ATCCの	TIB-152	https://www.atcc.org/
硫酸カナマイシン	MPバイオメディカル	194531
マルチチャンネルピペット(30-300μL)	エッペンドルフ、または類似のもの
ネオントランスフェクションシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MPK5000
ネオントランスフェクションシステム、10 μL キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MPK1096
Nunc 15 mL コニカル滅菌遠心チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	339651
ピペットチップ 0.1-20μl	エッペンドルフ、または類似のもの	0030 075.005
ピペットチップ 2-200μl	エッペンドルフ、または類似のもの	0030 075.021
ピペットチップ50-1000μl	エッペンドルフ、または類似のもの	0030 075.064
pX458-DSRed2	アドジーン	112219
RAW264.7	ATCCの	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 ミディアム	ハイクローン	01 SH30027日
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
トリパンブルー溶液、0.4%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061
1.5 mLマイクロチューブ、PCRクリーン	エッペンドルフ、または類似のもの	0030 125.215
24ウェルクリアTC処理マルチウェルプレート	コーニング	3524

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