Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing:二本鎖ホモロジー依存性修復機構によるヒト多能性幹細胞のゲノム改変技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 編集用の幹細胞を準備する

1. ゼラチン上で増殖させたマイトマイシンC不活化マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダーの2.4 × 10⁶細胞/プレートを含む6ウェルプレート上で、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を増殖および培養します。hPSCをウェルあたり3 mLのヒト胚性幹細胞培地(hESC培地)に保持し、37°Cのインキュベーターで3% O₂/5% CO₂.
   で増殖させます。 手記：このプロトコルを成功させるために、低酸素インキュベーターでhPSCを維持する必要はありません。ただし、hPSCは高O₂環境ではより速く増殖するため、時間と細胞数はそれに応じて調整する必要があることに注意することが重要です。また、低酸素で維持されたhPSCは、自然分化の速度が低いことにも注意する必要があります。
   1. 500 mLのhESC培地を作るには、380 ml DMEM/F12、75 mlのウシ胎児血清(FBS)、25 mLのノックアウト血清交換(KSR)を組み合わせます。グルタミン(最終濃度 1 mM)、100x 非必須アミノ酸 5 mL、ペニシリン-ストレプトマイシン 100 単位/mL (P/S)、塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF) (最終濃度 4 ng/mL)、および 2-メルカプトエタノール (最終濃度 5.5 μM )を添加します。
2. ガラスピペットと掃除機を使用して、メディアの全容量(3 ml)を取り出してメディアを交換します。血清学的ピペットを使用して、3 mLの温かいhESC培地と交換します。hPSCが約50%コンフルエントになるまで、毎日培地交換を繰り返します(Day-1)。
3. ターゲティングの1日前(Day-1)に、hESC培地を交換し、古い培地を取り出し、10μM Y-27632を添加した温かいhESC培地を追加します。
4. また、-1日目に、DR4マウス由来の薬剤耐性MEFフィーダー細胞(2.4 × 10⁶細胞/プレート)の6ウェルまたは10 cmプレートを1〜2枚調製します
   注:一般に、6ウェルプレートは10cmプレートよりも有利です。これは、より多くのメディアを収容するためです。また、6ウェルプレートにより、異なるウェルの異なるクローンが独立していることが保証されます。ただし、10cmのプレートを使用すると、このプロセスで利用可能な顕微鏡によっては、ピッキングが容易になります。

>2. 多能性幹細胞の編集

1. トランスフェクション溶液を調製するには、ZFN 1および2(図1)をそれぞれ5 μgずつ1.5 mLのチューブにピペットで移します。修復プラスミド30μgをこのチューブにもピペットで入れます。最後に、1x Phosphate Buffered Saline(PBS)をチューブにピペットで挿入し、容量を最大300 μl.
   にします。 手記：トランスフェクション溶液の総量を300 μl未満に保つために、最小濃度300 ng/μlのミドプレップ(任意のキットが適切)としてプラスミドを調製します。フェノール/クロロホルム抽出を行ったり、プラスミドを直鎖化したり、エンドトキシンフリーのプラスミド調製キットを使用したりする必要はありません。
2. ガラスピペットと真空機を使用してhPSCから培地を取り出します。各ウェルに2 mlの温かい1x PBSをピペットで入れて、細胞を洗浄します。
3. ガラスピペットと掃除機を使用して、PBSをすぐに取り外します。0.5 mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を各ウェルの細胞に直接加えます。インキュベーター(37°C/5% CO₂/3% O₂)に約10分間、またはフィーダー層がプレートから浮き上がり始めるまで置きます。
4. 2 mLの温かいesWash培地(470 ml DMEM/F12、25 ml FBS、100 units/ml P/S)を各ウェルに加え、トリプシン反応を停止します。
5. フィーダーセルがシート状に剥がれることを確認します。各ウェルの内容物を1本の50 mlコニカルチューブにピペットで移し、すべてのウェルを組み合わせます。10 mLの血清学的ピペットを使用して細胞を三静化します。フィーダー層を分割する必要はありません。hPSCは、穏やかなトリチュレーションによってフィーダー層から外れます。細胞懸濁液は約15mlあるはずです。
6. 25 mLのesWash培地をチューブに加えると、合計40 mLになります。大きなフィーダーチャンクをチューブの底に1〜2分間沈殿させます。血清学的ピペットを使用してチューブから上清 (~38 ml) を取り除き、新しい 50 ml の円錐形チューブに沈着させます。
7. 190 x gで5分間スピンダウンし、ガラスピペットと掃除機を使用してチューブから上清を取り除きます。細胞ペレットを乱さないように注意してください。細胞を500 μl 1x PBSに再懸濁します。以前に調製したプラスミドトランスフェクション溶液と組み合わせます。このステップでセルを数えます。エレクトロポレーションごとに5〜1,000万個のセルを使用します。
8. 800 μlの懸濁液全体を4 mmエレクトロポレーションキュベットにピペットで移し、氷上に3〜5分間置いて、エレクトロポレーションシステムの指数関数的プログラムを使用してセルをエレクトロポレーションします。パラメータ:250 V、500 μF、∞抵抗、および4 mmキュベットサイズ。エレクトロポレーション後、キュベットを氷の上に3分間戻します
   手記：エレクトロポレーションシステム上でエレクトロポレーションの時定数を観察します。時定数は、細胞数とDNA純度によって異なります。トランスフェクションが成功すると、通常、リストされた条件と遺伝子パルサーIIを使用した場合、時定数は10〜14ミリ秒になります。エレクトロポレーション効率の低下は、時定数がこれらの値から変化すると発生する可能性があります。
9. エレクトロポレーション細胞を、10 μM Y-27632を添加した18 mLの温かいhESC培地に再懸濁します。この単一細胞懸濁液を3 mLを、DR4フィーダーセルを備えた6ウェルプレートの各ウェルにプレートします。インキュベーターに戻ります(37°C / 5%CO₂ / 3%O₂)。

>3. ポジティブコロニーの選択

1. 2日目は、ガラスピペットと掃除機を使用してすべてのメディアを取り出します。10 μM Y-27632を添加した3 mLの温かいhESC培地と交換します。3日目は、ガラスピペットと掃除機を使用してすべてのメディアを取り除きます。Y-27632を含まない3mlの温かいhESC培地と交換してください。4日目は、ガラスピペットと掃除機を使用してすべてのメディアを取り出します。選択のために抗生物質を補充した3 mLの温かいhESC培地と交換してください。インキュベーターに戻る (37 °C/5% CO₂/3% O₂).
   手記：使用する抗生物質の種類は、修理テンプレートに含まれる耐性カセットによって異なります。WIBR#3 hPSC(NIHレジストリ0079)を用いた場合、0.5 μg/mlのピューロマイシン、70 μg/ml のG418(遺伝薬)、35 μg/mlのハイグロマイシンが問題なく使用されています。選択のための濃度は、約1週間以内に野生型細胞を殺すために必要な抗生物質の最小濃度を確立することにより、経験的に決定する必要があります。
2. 5〜12日目、毎日培地を交換し、毎回古い培地を抗生物質を補充した温かいhESC培地と交換します.
   手記：大量の細胞死が予想されます。個々のコロニーは、8〜10日目頃に明らかになります。抗生物質を含まない通常のhESC培地は、12〜14日間の連続選択後に使用できます。細胞密度が高い場合、または細胞死が遅い場合は、培地の酸性化を避ける必要があり、選択の最初の数日間に培地の量(最大4〜5 ml)を増やす必要がある場合があります。

図 1.AAV-CAGGS-EGFP修復テンプレートを使用した遺伝子編集されたAAVS1遺伝子座の概略図。Hockemeyer et al., 2009 から改変。