TALEN媒介標的遺伝子組み込み:hiPS細胞への蛍光タンパク質遺伝子の精密挿入のための遺伝子組換え配列特異的ヌクレアーゼの使用

Abstract

出典:Cerbini, T. et al.GFP遺伝子をTALEN標的とするヒト誘導多能性幹細胞のAAVS1セーフハーバーへのトランスフェクション、選択、およびコロニーピッキング。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の正確なゲノム編集技術について説明しています。TALENを使用して標的遺伝子座に二本鎖切断を作成し、蛍光タンパク質遺伝子の統合のための相同性指向性修復を誘導します。

Protocol

1. プラスチック製品の基底膜マトリックスの調製とコーティング

1. -20°Cで凍結した基底膜マトリックスストックを氷の上に置き、4°Cで一晩解凍します。
2. 解凍後、基底膜マトリックスの2 mgアリコートを事前に冷却したエッペンドルフチューブにピペットで移します。必要になるまで-20°Cで保存してください。
3. 基底膜マトリックスコーティングプレートを調製するには、エッペンドルフチューブの最後の氷片が消えるまで(通常は~2時間以内)、氷上で1つのアリコートを解凍します。
4. 解凍後、12 mlの冷(4°C)DMEM / F12に基底膜マトリックスを加えて、基底膜マトリックスコーティング溶液を作ります。
5. 基底膜マトリックス溶液を適切な培養容器に加えます。6ウェルプレートの場合、ウェルあたり1 mlを分注します。プレートを渦巻いて、基底膜マトリックス溶液が各ウェルを完全に覆っていることを確認します。
6. パラフィルムは、基底膜マトリックスコーティングされたプレート/ディッシュをシールし、使用前に室温で1時間インキュベートします。または、基底膜マトリックスコーティングされたプレート/ディッシュを4°Cで保管し、コーティング後2週間以内に使用してください><。 手記：乾燥を防ぐために、基底膜マトリックスコーティングプレート/ディッシュにDMEM/F12を追加します。4°Cで保存した基底膜マトリックスコーティングプレート/ディッシュを使用する前に、生物学的安全キャビネットに入れ、室温に戻して少なくとも30分間待ちます。
7. 培地と細胞を添加する前に、基底膜マトリックスを完全に吸引します。

2. E8培地の準備

1. E8サプリメントを4°Cで一晩解凍することにより、E8培地を調製します。
2. 500 mLのストックから10 mlのE8基礎培地を取り出して廃棄します。
3. E8サプリメントの10 mlバイアル全体を490 mlのE8基礎培地に直接ピペットで移します。E8用培地を37°Cのウォーターバスで温めないでください。温度変動を繰り返すと、E8用培地中のbFGFが劣化する可能性があります。
4. サプリメントの追加から2週間以内に完全なE8培地を使用してください。

>3. iPS細胞の解凍

1. 凍結したiPS細胞のバイアルを液体窒素から取り出し、ドライアイスの上に置きます。
2. バイアルを37°Cのウォーターバスで急速に解凍し、氷の小さな破片だけが残るまでバイアルをウォーターバスで渦巻きます。
3. バイアルに70%エタノールをスプレーし、生物学的安全キャビネットに移します。
4. 1 mLの室温E8培地をバイアルに直接滴下します。
5. 2 mLピペットを使用して、細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブ内の9 mLのE8培地に滴下に移します。チューブを頻繁に回転させて、細胞と培地がすばやくよく混ざり合うようにします。
6. 細胞を200 x gで5分間遠心分離します。
7. 上清を吸引し、10 μM Y-27632を添加したE8の適切な容量に細胞ペレットを再懸濁します。
8. 細胞を適切な数の基底膜マトリックスコーティングウェルに加え、37°C、5%CO₂インキュベーターに一晩置く。融解後の迅速な回収を可能にするために、6ウェルプレートのウェルあたり少なくとも0.2 x 10⁶ iPS細胞をプレート化することをお勧めします。

4. iPS細胞のメンテナンスと定期通過

1. E8ミディアムを毎日更新します。
2. 倒立顕微鏡で細胞の形態と密度をモニターします。高品質のiPS細胞は、明確な境界を持つ平らなコロニーで増殖します。個々のコロニーは「丸石のような」外観をしています。
3. iPSC細胞が~70%のコンフルエント度に達したら、細胞を継代します。
4. 500 mL DPBSに0.9 g NaClと0.5 M EDTA500 μlを添加して、EDTA継代溶液を調製します。よく混ぜてNaClを溶かし、真空フィルターで滅菌します。継代する前に、継代溶液のアリコートを37°Cの水浴で温めます。
5. 継代するには、使用済みの培地を吸引し、同量の温かい継代溶液で細胞を一度洗浄します。吸引し、細胞をコーティングするのに十分なEDTA継代溶液をピペットで掴みます(6ウェルプレートのウェルあたり1ml)。
6. 細胞を倒立顕微鏡下に置き、iPS細胞のコロニーを観察します。コロニー内の穴と隆起した境界の出現は、2〜5分以内に明らかになるはずです。
7. EDTA継代溶液を慎重に吸引します。
8. 10 mLピペットを使用して、4 mLのE8培地(6ウェルプレートを使用している場合)を高圧下で直接分注して、継代する各ウェルに分注します。
9. iPSCの塊を採取し、1:8から1:12までの分割比に応じて適切な数のウェルに分割します。ピペットを過剰に使用しないでください、細胞塊の凝集が解散すると生存率が低下します。
10. プレートをインキュベーターに入れ、プレートを前後左右に数回揺さぶって細胞を分散させます。

5. トランスフェクションのためのMEFとiPS細胞の調製

1. トランスフェクションの48時間前に、iPS細胞を~1:6で基底膜マトリックスコーティングした6ウェルプレートの4つ以上のウェルに通過させ、2日後には70%がコンフルエント
になるようにします。
2. 翌日、DR4 MEFをDMEM(高グルコース)に10%FBSと1x MEM-NEAAを添加したMEF培地に解凍します。
3. DR4 MEFを2つの10 cmディッシュに~2 x 10⁴ cells/cm²でプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
4. トランスフェクション当日は、iPSCでトランスフェクションを行う30分前に、MEF培地をE8に10μM Y-27632を添加したE8に交換します。
5. オプション:トランスフェクションの4時間前に、トランスフェクション前のiPSC培養液を最終濃度10 μMのY-27632で補填します。

>6. エレクトロポレーションシステムによるiPS細胞の穏やかな細胞解離試薬処理とトランスフェクション

1. P3 1 代細胞トランスフェクション溶液を 4 °C から取り出し、室温で ~30 分間静注します。使用前に、100 μl のサプリメント全体をトランスフェクション溶液に加えてください。
2. 37°Cの水浴中で温かく穏やかな細胞解離試薬。
3. -20°CからAAVS1 TALEN(pZT-AAVS1-L1およびpZT-AAVS1-R1)およびAAVS1-CAG-EGFPドナーを取得します。
4. インキュベーターからiPS細胞を取り出し、DPBSで一度洗浄します。
5. ウェルあたり1 mLの穏やかな細胞解離試薬を添加し、iPS細胞を37°Cで5分間、または細胞の50%以上が培養容器から解離するまでインキュベー
トします。
6. p1000ピペットを使用して細胞を数回上下にピペットで動かし、培養容器から残っている細胞を解離し、iPS細胞の凝集体をバラバラにします。
7. 各ウェルに2 mLのE8培地を加え、10 mLのピペットを使用して数回上下にピペットで動かし、細胞凝集体をさらに単一細胞に分解します
   手記： 細胞塊が十分に解凝集していないと、トランスフェクション効率が大幅に低下します。
8. iPS細胞を15 mLのコニカルチューブに集め、100 x gで3分間遠心分離します。
9. 上清を吸引し、細胞を最小限のE8培地に再懸濁します。
10. 0.4% Trypan blueなどのバイタルステインを適用した後、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。カウント中に細胞が十分に解離していることを確認してください(「塊」あたり1〜3個の細胞)。
11. 3 x 10⁶細胞を2本の15 mLコニカルチューブのそれぞれに分注し、100 x gで再度スピンダウンして3分間
    手記： 低速遠心分離により、細胞のストレスが軽減され、エレクトロポレーション前のiPS細胞の再懸濁が容易になります。
12. エレクトロポレーションシステムをヒト胚性幹細胞株H9の細胞種特異的プログラム(プログラムCB-150)に設定します。
13. 遠心分離後、細胞ペレットから上清を吸引します。1つのペレットに、コントロールサンプルとして10 μgのHRドナーを加えます。もう一方のペレットに、実験サンプルとして各TALEN(pZT-AAVS1-L1およびpZT-AAVS1-R1)の5μgとともに、HRドナー10μgを追加します。
14. 各細胞ペレットを100 μlのP3初代細胞トランスフェクション溶液に再懸濁し、キュベットに移します。
15. トランスフェクションを行い、直ちに室温のE8培地500μlを各キュベットに加えます。
16. トランスフェクションしたiPS細胞を、ステップ5.4で調製したDR4 MEFが入った10cmディッシュ1枚に滴下します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
マトリゲル成長因子減少(GFR)基底膜マトリックス、* LDEVフリー、10 ml	コーニング	354230	-20°Cで保存してください。
DMEM/F-12	ライフテクノロジー	〒11320-033	4°Cで保存してください。
Costar 6 Well Clear TC 処理マルチウェルプレート	コーニング	3506
エッセンシャル 8 ミディアム	ライフテクノロジー	A1517001	基礎培地は4°Cで保存し、サプリメントは-20°Cで保存してください。
Y-27632二塩酸塩	トクリス	1254	室温で保管してください。H2Oに溶解したら、-20°Cで保存します。
塩化ナトリウム	シグマ	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0	ライフテクノロジー	15575-020
DPBS、カルシウム、マグネシウム不使用	ライフテクノロジー	14190から250
100 mm TC処理培養皿	コーニング	430167
DR4 MEF 2M IRR - アカデミック	グローバルステム	GSC-6204Gの	液体窒素で保存します。
DMEM, 高グルコース, ピルビン酸	ライフテクノロジー	11995年040	4°Cで保存してください。
定義された胎児ウシ血清、米国原産	ハイクローン	03 SH30070月	-20°Cで保存し、4°Cで一晩解凍し、分注します。アリコートは必要になるまで-20°Cで保存してください。
MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)	ライフテクノロジー	11140-050	4°Cで保存してください。
4D-Nucleofector コアユニット	ロンザ	AAF-1001Bの	エレクトロポレーションシステムの一部。
4D-ヌクレオフェクターXユニット	ロンザ	AAF-1001X	エレクトロポレーションシステムの一部。
P3 初代細胞 4D-ヌクレオフェクター X キット L (24件の比較試験)	ロンザ	V4XP-3024	到着したら、初代細胞溶液を取り出して補充し、4°Cで保存します。
StemPro Accutase 細胞解離試薬	ライフテクノロジー	A1110501	-20°Cで保存し、4°Cで一晩解凍し、使用前に37°Cの水浴でアリコートを温めてください。
NutriStem XF/FF培地	ステムジェント	2005年01月	-20°Cで保存し、4°Cで一晩解凍します
AAVS1 タレン (pZT-AAVS1-L1 および pZT-AAVS1-R1)	アドジーン	52637 および 52638
AAVS1-CAG-EGFP相同組換えドナー	アドジーン	22212
ピューロマイシン二塩酸塩	ライフテクノロジー	A11138-03 (日本語版)	-20°Cで保存し、ddH2O中に1 mg/mlの作業用アリコートを調製します。
ディスポーザブルホウケイ酸ガラスパスツールピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-20A
Sorvall Legend XTR(冷蔵)、120 V 60 Hz	サーモサイエンティフィック	〒75-004-521
TX-750 4 × 750 ml スイングバケットローター	サーモサイエンティフィック	75003607
トリパンブルー溶液、0.4%	ライフテクノロジー	15250-061