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1. マイクロインジェクションミックス用プラスミドの調製
>注:ここに示されているプロトコルは、2つのプラスミドの使用を含みます:目的の導入遺伝子を運ぶattB(宿主細菌に由来する付着部位)タグ付きドナープラスミドと、ショウジョウバエHsp70プロモーターの調節下でφC31インテグラーゼを発現するヘルパープラスミド。
- エンドトキシンフリープラスミド精製キットを使用してドナープラスミドとヘルパープラスミドを精製します.
手記：注入に使用した最終的なプラスミド調製物をシーケンシングし、すべての成分の完全性を確認します。
- 2つのプラスミドを適切な量で組み合わせて、注入バッファーに再懸濁したときの最終濃度が350 ng/μLのドナープラスミドと150 ng/μLのヘルパープラスミドの混合物を得ます。
手記：必要な混合物の量を計算する際には、計画された注射の各日に10〜15μLで十分であり、DNAを事前に調製して-20°Cで保存できることを考慮してください。
- 0.1容量の3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)と2.5容量の氷冷100%EtOHおよびボルテックスを添加して、DNAを沈殿させます。白い沈殿物がすぐに見えるはずです。高濃度の初期プラスミド調製(すなわち、~1 μg/μL)を有すると、沈殿効率が向上する。
手記：停止点 - 降水は-20°Cで一晩保存できます。
- 15,000 x gで4°Cで20分間遠心分離し、上清を捨て、ペレットを氷冷した70% EtOH1 mLで洗浄します。
- ペレットを氷冷した70% EtOH1 mLで洗浄し、15,000 x gで室温で5分間遠心分離します。
- ペレットを乱さずに上清を捨て、風乾します。
- ペレットを1x注入バッファー(0.1 mM Na3PO4、5 mM KCl、pH 7.2、0.22 μmフィルター滅菌済み)に再懸濁して、最終濃度が500 ng/μL.
になるようにします。
手記：降水プロセス中に一部のDNAが失われると仮定します。したがって、最初に少量の注入バッファーを追加し、分光光度計(Nanodropなど)で濃度を確認してから、適切な残りの容量を追加して500 ng/μLに到達します。
- DNAが完全に再懸濁されていることを確認し、それぞれ10〜15μLのアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
- 注射当日は、1つのアリコートを解凍し、15,000 x gで5分間遠心分離して、粒子残留物を除去します
注:微粒子除去の代替方法は、0.22μmフィルターで溶液をろ過することです。注入混合物に粒子状残留物が存在すると、胚マイクロインジェクション中に針が詰まるので避けてください。
2. ハマダラカのドッキングラインからの胚のマイクロインジェクション
- 血液は、マイクロインジェクションの72時間前に、目的のドッキングラインから生後4〜7日の蚊に餌を与えます(つまり、月曜日と火曜日の注射の場合は、前の金曜日にメスに餌を与え、木曜日と金曜日の注射の場合は、同じ週の月曜日にメスに餌を与えます)。
- 野生型(WT)蚊(すなわち、ドッキングラインのゲノム背景が同じ蚊)を同日に血液供給する;これらはアウトクロスに必要になる
手記：血粉のサイズと品質は卵の品質に影響を与えるため、常に新鮮な血液(つまり、過去7日以内に採取された血液)を使用することをお勧めします。腕の給餌またはマウスへの給餌は、卵の質と量を増やす可能性がありますが、これらの方法は推奨されません。特定の承認されたプロトコルは、人間と動物の使用に必要になります。
- 胚マイクロインジェクションの実施
- An. gambiae胚マイクロインジェクションを25 mM NaClで行い、胚の後極を45度の角度で標的とします。胚の収集、アライメント、およびマイクロインジェクションの詳細なプロトコルについては、Pondevilleらを参照してください。とLoboら。
- ハロカーボンオイル700:27(2:1)でAn.stephensi胚マイクロインジェクションを行い、胚の後極を30度の角度で標的とします。胚の収集、アライメント、およびマイクロインジェクションの詳細なプロトコルは、Tereniusらに記載されています。とLoboら。
- 滅菌蒸留水(pH 7.2)で満たされたペトリ皿に注入直後に卵を移し、昆虫の状態に戻します。
- 孵化したら、G0の幼虫を塩漬けの蒸留水(0.1%トニック塩)を入れたトレイに毎日移し、蛹に育てます。
- 孵化率の記録(すなわち、孵化した幼虫の数/注入された胚の数).
手記：胚の動きは孵化を助けるので、穏やかな渦巻きが望ましいです。孵化は、注射後~48時間で開始する必要があります。注射はわずかな発育遅延を引き起こす可能性があるため、孵化が遅れた幼虫を3〜4日間監視し続けることをお勧めします。