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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. プロトスペーサーの定義とプラスミドの構成
>注:このセクションでは、sgRNAを構築し、さらにpMaOri.dCas9にライゲーションするための適切なプロトスペーサーを選択する最初のステップについて説明します(図1)。このプロトスペーサー配列は、目的の標的に対する20ヌクレオチド配列で構成されています。
- GenBankでサイレンシングする目的遺伝子の塩基配列を取得します(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。「Fasta Target」を選択した後、Streptococcus pyogenes Cas9およびprotospacer adjacent motif NGGのパラメータを定義して、CHOPCHOPウェブサーバー(http://chopchop.cbu.uib.no/)に送信します。パラメータを「CRISPR/Cas9」とPAM(protospacer adjacent motif)NGGに定義します。
- 得られた結果に基づいて、コード領域の5'末端にできるだけ近くに位置し、最も重要なことに、sgRNAが完全な遺伝子サイレンシングのために遺伝子のコード鎖とペアになる必要があるため、テンプレート(マイナス)鎖に含まれている、可能な限り最高のスコア(緑の矢印)を持つプロトスペーサーを選択します。
手記：NGGモチーフは、最終的なsgRNA配列に含まれていません。
- lipL32プロモーターを使用して、5'末端に可変の20ヌクレオチド配列と保存されたdCas9足場配列を含むシングルガイドRNAを発現させます。プロトスペーサーと呼ばれる20-nt配列をlipL32プロモーター(5'末端)とsgRNAスキャフォールド(3'末端)にマージします(図1B)
手記：明確に定義されたlipL32プロモーターについては、TSS(Transcription Start Site、Zhukovaらに基づく)に対して-334を含むプロモーター領域を利用します。最終的なsgRNAカセットについては、表1を確認してください。
- シーケンシャルPCRによってsgRNAカセットを生成するか、商用プロバイダーに合成してもらいます。
- カセットを入手したら、両端のXmaI制限部位(cccggg)でpMaOri.dCas9プラスミドにライゲーションします。
- sgRNAカセットとpMaOri.dCas9プラスミドの両方をXmaI制限酵素で消化し、ライゲーションに進みます(図1B)。
- dT補助栄養性大腸菌株π1のクローニングステップは、pMaOri(およびひいてはpMaOri.dCas9)の複製起点R6K-gamma.
注:ライゲーションとクローン選択の詳細なプロトコールについては、FernandesとNascimentoによる以前の出版物を参照してください。sgRNA誘導dCas9は、選択した目的遺伝子のコード鎖に結合するため、RNAポリメラーゼの伸長を阻害し(図1C)、遺伝子サイレンシングを引き起こします。
2. 共役によるレプトスピラ変換
>注: この手順のグラフィカルなスキームを図 2 に示します。HAN培地およびHANプレートの作製については、HornsbyらおよびFernandesらを参照してください。
- 攪拌下でHAN培地中で病原性レプトスピラ細胞を増殖させるには、新鮮なHANで飽和培養液を1:100で希釈します。通常、L. interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130は、適切な細胞密度に達するまでに4-6日かかります。
- コンジュゲーションに使用する前に、培養物が420 nm(2〜5 x 108細胞/mL)で0.2〜0.4のO.D.に達することを確認してください><。
手記：HAN培地は細胞密度が増加すると色が変わるため(DMEM培地に含まれるフェノールレッドのため)、培地1mLを遠心分離(4,000×g、15分、室温)してレプトスパイアを除去し、上清をブランクとして塗布して外径を測定する。
- ジアミノピメリック酸(DAP)の補助栄養性である共役大腸菌株β2163を、sgRNAカセットを含むプラスミドpMaOri.dCas9で形質転換します。大腸菌の形質転換には、ヒートショックプロトコルまたはエレクトロポレーションのいずれかを使用します。プラスミドpMaOri.dCas9とsgRNAカセットを含まない形質転換をコントロールとして含めます。
- ヒートショック形質転換のために、プラスミドDNA(100 ng)を化学的にコンピテントな大腸菌細胞と混合し、氷上で30分間インキュベートします。42°Cで90秒間ヒートショックを行い、再び氷上に5分間置きます。LB培地1 mLを加えて細胞を回収し、37°Cで1時間インキュベートし、プレーティングに進みます。
- エレクトロポレーションには、100 ngのプラスミドDNAと混合したエレクトロコンピテントセルを使用します。パルスには、1.8 kV、100 Ω、25 μFのパラメータを使用します。上記で説明したように、セルを回復します。
- 形質転換ドナー大腸菌細胞を、ジアミノピメリン酸(DAP)(0.3 mM)およびスペクチノマイシン(40 μg/mL)を添加したLB寒天培地にプレート化して、プラスミドを選択します。
- 標識については、標識の日の1日前に各プレートから1つのコロニーを選択します(これは、レプトスパイアの培養物のO.D.を監視することによって決定されます)。
- 空のpMaOri.dCas9から大腸菌β2163のコロニーを1つ選択し、pMaOri.dCas9sgRNAプレートから1つのコロニーを選択します。10 mLのLBとDAPおよびスペクチノマイシンを併用して37°Cで一晩増殖させます。
- 翌日、飽和培養物を10 mLの新鮮なLBとDAP(ここには抗生物質を含めないでください)で1:100に希釈し、OD420nmが0.2〜0.4になるまで希釈します。通常、大腸菌がこれらの密度に達するには2〜3時間かかります。
- BSL2バイオセーフティフードの内側に、ガラスベースの上部に直径25mm、孔径0.1μmの混合セルロースエステルメンブレンフィルターを配置してろ過装置を組み立てます。15 mLのガラス漏斗を上部に置き、両方のピースをスプリングクランプで保持します。ガラスを真空ポンプに接続し、培養物を漏斗に加えてろ過します。
- 5 mLのレプトスピラ培養物を漏斗に加えます。大腸菌の体積を追加して、両方の培養物のOD420nm値に基づいて1:1の比率を構成します。真空ポンプをオンにし、ろ過により細胞を濃縮します。メンブレンフィルターで細胞を濃縮した後、慎重に回収します。媒体がメンブレンを通してろ過されていることを確認します.
手記：ろ過には5〜10分かかります。
- DAP(0.3 mM)を添加した市販のEMJHプレート(材料の表を参照)にフィルターを置きます。バクテリア側が上になっていることを確認してください。プレートを29°Cで24時間インキュベートします
手記：HANまたは補充された社内EMJHプレートを使用すると、大腸菌が増殖して意図した1:1の割合を克服する可能性があり、その結果、標識効率が低下する可能性があります。
- 24時間後、プレートからフィルターを回収し、個々のフィルターを50 mLの円錐チューブに入れます。
- 1 mLの液体HAN培地を使用して、広範なピペッティングとボルテックスにより細胞をフィルター表面から放出します。
- 回収した混合細菌溶液を暗視野顕微鏡で可視化し、細胞の生存率と運動性、およびレプトスピラ:大腸菌の割合を確認します.
手記：この段階では、同数の大腸菌とレプトスピラが見られます。
- この培養物100-200μLを、0.4%不活化ウサギ血清および40μg/mLスペクチノマイシンを含むHANプレートに広げます。プレートを37°Cで3%CO2雰囲気中でインキュベートします.
strong>注:通常、L. interrogans serovar Copenhageni株Fiocruz L1-130細胞は、コントロールプレート上で5〜7日で、スペクチノマイシンプレート上で8〜10日でコロニーを形成します。この段階では、大腸菌はDAPの補助栄養性であるため、成長しません。
- 対照として、レプトスパイラルの成長をモニタリングするために、培養物を104レプトスパイア/mLで希釈し、抗生物質を含まないプレートに100μLを加えます。