出典:Jager, J. et al.An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function.(タンパク質とマイクロRNA調節が脂肪細胞機能に与える影響を研究するための脂肪細胞培養モデル )。
この動画では、siRNAを脂肪細胞に逆トランスフェクションして標的タンパク質の発現を調節する手順を説明しています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
in vitroでのsiRNA逆トランスフェクションベースの遺伝子サイレンシング:培養細胞に低分子干渉RNAを送達して標的遺伝子発現を不活性化する手順
3.8K 閲覧数
⸱
2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. プレコートプレートの準備
- トランスフェクションの前日または数時間前に、1 mg/mLのストック溶液から30%エタノール中のI型コラーゲン溶液を100 μg/mLで調製します。12ウェルプレートのウェルあたり250 μL、24ウェルプレートのウェルあたり125 μLのコラーゲンを添加し、溶液をウェルの表面に広げます。
- コラーゲンが乾くまで、蓋をせずにプレートを培養フードの下に置いておきます。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で2回洗浄します
注:プレコートプレートは購入可能です。
2. トランスフェクションミックスの調製
>注:siRNAの最終濃度は1〜100 nMです(12ウェルプレートのウェルあたり1〜100 pmolのsiRNA)。miR模倣液の最終濃度は10 nM(10 pmol/well)です。オフターゲット効果を避けるために、実験を開始する前に、各siRNA、miR mimic、またはその他のオリゴヌクレオチドの最適な濃度を決定してください。トランスフェクション実験を3回に分けて実施し、結果の統計解析を容易にします。ピペッティング中の正常な損失を考慮して、すべての試薬を過剰に調製します。
- siRNA(または他のオリゴヌクレオチド)をピペッティング(容量/容量)して、改良したMinimal Essential Mediumと混合します(表1)。室温で5分間インキュベートします。
- トランスフェクション試薬と改良したMinimal Essential MediumをsiRNAに加え、ピペットで混合します(表1)。室温で20分間インキュベートします(この間にセクション3に進みます)。トランスフェクションミックスをコラーゲンコーティングプレートの各ウェルに加えます。
3. 3T3-L1脂肪細胞の調製
- 100 mmシャーレ内の細胞をD-PBSで2回洗浄します。細胞に5倍トリプシン(100mm皿あたり1mL)を加え、トリプシンですべての表面を覆うことを確認します。30秒待ってから、トリプシンを慎重に取り除きます。
- インキュベーター内でペトリ皿を37°Cで5〜10分間インキュベートします。100mmディッシュをタップしてセルを切り離します。
- ピルビン酸を含まないDMEM10 ml、グルコース25 mM、FCS10%、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えて、トリプシンを中和します。.培地を慎重に上下にピペッティングして細胞を剥離し、細胞懸濁液を均質化します。
- Malassezカウントチャンバーまたは自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、細胞の濃度を6.25 x 105細胞/mLの培地に調整します。トランスフェクションミックスを含む12ウェルプレート(5 x 105細胞)の細胞懸濁液/ウェル800 μL、またはトランスフェクションミックスを含む24ウェルプレート(2.5 x 105細胞)の細胞懸濁液/ウェル400 μLをシードします
手記：脂肪細胞の100 mmシャーレ1枚で、12ウェルプレート1枚または24ウェルプレート1枚を調製できます。100 mmディッシュには通常、6-7 x 106個の脂肪細胞が含まれており、これは12ウェルプレートのウェルあたり5 x 105個の脂肪細胞に相当します。 - 細胞培養インキュベーター(7%CO2および37°C)でプレートをインキュベートし、細胞を24時間乱さないでください。翌日、上清をピルビン酸を含まない新鮮なDMEM、25 mMグルコース、10%FCS、1%ペニシリンとストレプトマイシンと慎重に交換します
注:コラーゲンプレコートされた48ウェルプレートと96ウェルプレートに細胞を播種することも可能ですが、培地を交換する際には、脂肪細胞の剥離を避けるためにより多くの予防策を講じてください。
| ウェルあたり(12ウェルプレート) | ウェルあたり(24ウェルプレート) | |
| オリゴヌクレオチド | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA、miR...) | ||
| 改良型ミニマルエッセンシャルミディアム | 20μL | 10 μL |
| トランスフェクション試薬 | 5.6 μL | 2.8 μL |
| 改良型ミニマルエッセンシャルミディアム | 154.4μL | 77.2μL |
| トランスフェクションミックスの総量 | 200μL | 100μL |
>表1:12ウェルおよび24ウェルプレートフォーマットに必要なトランスフェクション試薬。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 12ウェル組織培養プレート | ダッチャー | 353043 | |
| 2.5% トリプシン (10x) | ギブコ | 15090-046 | D-PBSで5倍に希釈 |
| 2-プロパノール | シグマ | I9516 | |
| 3-イソブチル-1-メチルキサンチン | シグマ・アルドリッチ | D5879 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | シグマ | A7030 | |
| ふくらはぎの皮膚からのI型コラーゲン | シグマ・アルドリッチ | C8919 | |
| デキサメタゾン | シグマ・アルドリッチ | D1756 | |
| D-PBSの | ギブコ | 14190144 | |
| ダルベッコのモディファイドイーグルスミディアム(DMEM) | ギブコ | 41965062 | 4.5 g / L D-グルコース;L-グルタミン;ピルビン酸なし |
| エタノール | シグマ | 51976 | |
| miRIDIAN micro-RNA模倣体 | ホライゾンディスカバリー | ||
| FAM標識ネガティブコントロールsiRNA | インビトゲン | AM4620 | |
| 新生子牛血清 | ギブコ | 16010-159 | |
| ウシ胎児血清 | ギブコ | 10270-106 | |
| ペニシリンとストレプトマイシン | ギブコ | 15140-122 | |
| FAM標識ネガティブコントロールsiRNA | インビトゲン | AM4620 | |
| ON-TARGETplus マウス Plin1 siRNA スマートプール | ホライゾンディスカバリー | L-056623-01-0005 | |
| 遊離グリセロール試薬 | シグマ・アルドリッチ | F6428 | |
| ペトリ皿 100 mm x 20 mm | ダッチャー | 353003 | |
| トランスフェクション試薬(インターフェリン) | ポリプラス | 409から10 | |
| 改良型ミニマルエッセンシャルメディウム(Opti-MEM) | ギブコ | 31985-047 | |
| インスリン、ヒト組換え体 | ギブコ | 12585-014 |
