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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 目的遺伝子(GOI)を発現する応答プラスミドの初代肺胞上皮細胞へのトランスフェクション
- ラットの肺からII型肺胞上皮細胞を単離します。
- 100 mmのペトリ皿に1 x 10 6細胞/ cm2の密度で細胞を播種し、完全な最小必須培地(完全なMEM)を使用します。完全MEMは、10%FBS、0.08 mg / Lトブラマイシン、セプトラ(3 μg / mLトリメトプリムおよび17 μg / mLスルファメトキサゾール)、0.2%NaHCO3、0.01 M HEPES(pH = 7.3)、および2 mM L-グルタミンを補充したMEMです。加湿インキュベーター内で細胞を5%CO2で37°Cで24時間培養します。
- 翌日、新しい12ウェルプレートの各ウェルに抗生物質を含まない500 μLの完全MEMを入れ、プレートを37°Cで30分間予温します。このステップでは、テトラサイクリンが汚染されていない、または誘導性を妨げるほど低すぎるレベルのウシ胎児血清を使用することが重要です。
- 誘導性GOI(GOIプラスミド)とレギュレーションベクター(pTet-Offなど)を含むプラスミドを含む1.5 mLチューブを調製し、RTでウェルあたり1 μgのGOIプラスミドと1 μgのレギュレーションベクターを添加します。RNA結合タンパク質(RBP)を用いた共発現実験では、目的のRPBを発現する構成的ベクター(pcDNA3など)1 μgをDNAミックスに添加します(図4)。
- 培地を吸引し、37°Cに予熱したPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない)で細胞を穏やかにすすぎます。
- 37°Cで予熱した0.05%トリプシン5mLを加え、細胞が剥離するまで(2〜4分)細胞をインキュベートします。抗生物質を含まない完全なMEMを10mL追加してトリプシンを中和します。.
- 細胞懸濁液を50 mLチューブに集め、ペトリ皿を4 mLの培地で洗浄して残りの細胞をできるだけ多く採取し、細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を穏やかに吸引して廃棄し、ペレットを1mLのPBSに再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞数をカウントし、計算します。
- 細胞を300 x gで5分間遠心分離し、上清を穏やかに吸引し、ペレットを4 x 107細胞/mLの濃度で再懸濁バッファーに再懸濁します。ステップ2.4で調製した1.5 mLチューブから、ウェルあたり400,000細胞の濃度で細胞を添加し、ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。
- チューブをエレクトロポレーション装置に入れ、3.5 mLの電解バッファーで満たします。
- 金メッキの電極先端をピストンを完全に押してピペットに挿入します。1.5mLチューブの内容物を穏やかに混合し、ピペットで細胞を慎重に吸引します。こて先に気泡が入らないように注意してください。エレクトロポレーション時にアーク放電が発生し、トランスフェクション効率の低下につながります。
- カチッという音がするまで、ピペットをエレクトロポレーションステーションに挿入します。
- 肺胞上皮細胞の適切なエレクトロポレーションプロトコルを選択し、パルス電圧1,450Vと幅20msの2パルスに対応し、タッチスクリーンでStartを押します。
- トランスフェクションの直後にピペットを取り外し、抗生物質を含まない完全MEMを事前に充填したウェルに細胞を移し、37°Cに予熱します。
- 残りのサンプルについて、手順1.11〜1.14を繰り返します。
- プレートを静かに振って、細胞をウェル表面に均等に広げます。加湿インキュベーターで細胞を5%CO2中で37°Cでインキュベートします。2日後、培地を抗生物質を含む完全MEMに交換します。
- トランスフェクションの成功を確認するには、蛍光顕微鏡でeGFPの発現を観察するか、コントロールベクターを用いたフローサイトメトリーで観察します(図1).
手記： このステップはオプションであり、pcDNA3-EGFPなどのeGFPを発現する別のプラスミドを使用した追加のトランスフェクションステップが必要です。
>2. GOIの転写阻害の誘導
>注:細胞をドキシサイクリン誘導前に所望の処理で前処理し、mRNAの安定性への影響を評価することができます(図3)。
- 脱イオン水に1 mg / mLのドキシサイクリンストック溶液を調製します。.ストック溶液は、光から保護して-20°Cで保管してください。テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリンは、テトラサイクリンよりも半減期が長い(2倍)ため、テトラサイクリンの代わりに使用されます。さらに、テトオペロンを完全に不活性化するには、より低濃度のドキシサイクリンが必要です.
手記：ドキシサイクリンは、内因性GOIのmRNA発現に影響を与える可能性があります。これを確認するには、ドキシサイクリンによる24時間治療の肺胞細胞に対する効果をテストして、GOI発現に変化がないことを確認する必要があります(図2)。
- トランスフェクション後72時間で、完全なMEMで新鮮な1 μg/mLドキシサイクリン溶液を調製し、37°Cに温めます。
- 培地をウェルあたり1 μg/mLのドキシサイクリンを含む1 mLの完全なMEMと交換して、GOIの転写を阻害します。
- 複数のウェルを5% CO2中37°Cで15分から6時間まで異なる時間インキュベートし、GOIのmRNA半減期を評価します。
- 処理の最後に、氷冷したPBSで細胞を洗浄し、市販のフェノール-クロロホルムRNA抽出キットでウェルあたり500μLのバッファーを加え、プレートを振とうして細胞を均質化します。
- メーカーのプロトコルに従ってRNAを単離します。230、260、および280nmの分光光度法により、RNAの収量と純度を測定します。260:230 と 260:280 の比率がそれぞれ 1.8 と 2.0 の RNA サンプルは、純粋と見なされます。
手記：ここでプロトコルを一時停止できます。
