シロイヌナズナ植物における二元細菌人工染色体ベクターに基づく遺伝子形質転換:シングルコピー挿入によるトランスジェニック植物作製技術

要約

出典:Tark-Dame, M., et al.BIBAC-GWバイナリベクトルを使用した単一コピー挿入によるトランスジェニック植物の生成。J. Vis. Exp.(2018年)。

この動画では、Agrobacteriumを介した二元細菌人工染色体ベースの遺伝子形質転換を通じて、安定した導入遺伝子を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の作製を実演しています。

プロトコル

1.シロイヌナズナ変換

1. シロイヌナズナの植物を形質転換のために準備します。
   1. シロイヌナズナの植物は、花が咲くまで温室または温度制御された成長室で育てます(ディッピングごとにそれぞれ9つの植物を含む12の鉢)。
   2. 最初のボルトをクリップして、より多くのセカンダリボルトが出現できるようにします。植物は、刈り取りの4〜6日後、植物が未熟な花の頭を多く持ち、施肥されたシリックがあまりない場合に浸す準備ができています。
2. フローラルディッピング
   1. 二元細菌人工染色体またはBIBACでクローニングされたT-DNAを運ぶAgrobacterium懸濁液中で5〜10秒間花序を浸します。穏やかに攪拌してください。
   2. 植物の地上部をラップフィルムで包んで湿度を高く保ち、植木鉢を箱で覆って植物を暗く保ちます。植物を温室/成長室で2日間インキュベートします。
   3. 箱とラップフィルムを取り外し、温室/成長室で植物を成熟まで育てます.
      手記：形質転換の効率を高めるために、最初の浸漬から7日後に同じ植物を再浸すことができます。
   4. 種を収穫します。同じ構成物で形質転換した植物の種子(T1)を1つのセットとしてプールして分析します。
3. トランスジェニック植物のスクリーニング。
   1. pBIBAC-RFP-GW誘導体で形質転換したトランスジェニック植物をスクリーニングするには、蛍光顕微鏡を用いて種子を分析します。種皮のDsRed発現を検出するには、560 nmの励起と600〜650 nmの発光で種子を画像化します。鉗子を使用して、蛍光性種子を非蛍光性対応物から分離します。
   2. pBIBAC-BAR-GW誘導体で形質転換したトランスジェニック植物をスクリーニングするには、土壌(~2,500種子/0.1 m²)で満たされたトレイに種子を播種します。トレー上に種子が均一に広がるように、0.5倍Murashige Skoog培地(MS)の0.1%寒天に種子を懸濁し、1mLのピペットを使用して種子を広げます><。 手記：種子が同期して発芽するように刺激するには、種子を4°Cで少なくとも2日間インキュベートします。これは、種を蒔く前または後に行うことができます。
      1. トレイに播種してから2週間後と3週間後に、苗に0.5%グルホシネート-アンモニウム溶液をスプレーします。1 m²あたり500 mLのグルホシネート-アンモニウム溶液を使用します。.
      2. 生き残った苗を個々の鉢に移します。図1に、グルホシネート-アンモニウム処理前(2回目)の苗木を載せたトレイの典型的な画像を示します。
      3. グルホシネート-アンモニウム耐性植物をPCRで分析し、目的のコンストラクトの存在を確認します。
         1. PCRのためにゲノム植物DNAを単離します。

結果

図1:グルホシネート-アンモニウム処理前後のシロイヌナズナの苗を詰めたトレイ。pBIBAC-BAR-GW T-DNAに存在するバー遺伝子を発現していない苗木は、グルホシネート-アンモニウム溶液を噴霧した後に死滅します。写真は、(A)グルホシネート-アンモニウムを散布する前、播種から14日後、(B)10日後に2回散布した後の苗の同じトレイを示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
硫酸カナマイシン一水和物	デュチェファ	K0126
Gateway LRクローナーゼ酵素ミックス	サーモサイエンティフィック - Invitrogen	11791-019
ムラシゲ・スクーグ・ミディア	デュチェファ	M0221
寒天	BDの	214010
グルホシネート-アンモニウム(バスタ)	バイエル	79391781
蛍光体イメージャー	GEヘルスケアライフサイエンス	台風FLA7000
ラップフィルム(サランラップ)	オムニラボ	1090681
アガロース	サーモサイエンティフィック - Invitrogen	16500

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