シロイヌナズナ植物における二元細菌人工染色体ベクターに基づく遺伝子形質転換:シングルコピー挿入によるトランスジェニック植物作製技術

Abstract

出典:Tark-Dame, M., et al.BIBAC-GWバイナリベクトルを使用した単一コピー挿入によるトランスジェニック植物の生成。J. Vis. Exp.(2018年)。

この動画では、Agrobacteriumを介した二元細菌人工染色体ベースの遺伝子形質転換を通じて、安定した導入遺伝子を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物の作製を実演しています。

Protocol

1.シロイヌナズナ変換

1. シロイヌナズナの植物を形質転換のために準備します。
   1. シロイヌナズナの植物は、花が咲くまで温室または温度制御された成長室で育てます(ディッピングごとにそれぞれ9つの植物を含む12の鉢)。
   2. 最初のボルトをクリップして、より多くのセカンダリボルトが出現できるようにします。植物は、刈り取りの4〜6日後、植物が未熟な花の頭を多く持ち、施肥されたシリックがあまりない場合に浸す準備ができています。
2. フローラルディッピング
   1. 二元細菌人工染色体またはBIBACでクローニングされたT-DNAを運ぶAgrobacterium懸濁液中で5〜10秒間花序を浸します。穏やかに攪拌してください。
   2. 植物の地上部をラップフィルムで包んで湿度を高く保ち、植木鉢を箱で覆って植物を暗く保ちます。植物を温室/成長室で2日間インキュベートします。
   3. 箱とラップフィルムを取り外し、温室/成長室で植物を成熟まで育てます.
      手記：形質転換の効率を高めるために、最初の浸漬から7日後に同じ植物を再浸すことができます。
   4. 種を収穫します。同じ構成物で形質転換した植物の種子(T1)を1つのセットとしてプールし....

Results

図1:グルホシネート-アンモニウム処理前後のシロイヌナズナの苗を詰めたトレイ。pBIBAC-BAR-GW T-DNAに存在するバー遺伝子を発現していない苗木は、グルホシネート-アンモニウム溶液を噴霧した後に死滅します。写真は、(A)グルホシネート-アンモニウムを散布する前、播種から14日後、(B)10日後に2回散布した後の苗の同じトレイを示しています。

....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
硫酸カナマイシン一水和物	デュチェファ	K0126
Gateway LRクローナーゼ酵素ミックス	サーモサイエンティフィック - Invitrogen	11791-019
ムラシゲ・スクーグ・ミディア	デュチェファ	M0221
寒天	BDの	214010
グルホシネート-アンモニウム(バスタ)	バイエル	79391781
蛍光体イメージャー	GEヘルスケアライフサイエンス	台風FLA7000
ラップフィルム(サランラップ)	オムニラボ	1090681
アガロース	サーモサイエンティフィック - Invitrogen	16500