シロイヌナズナ植物における二元細菌人工染色体ベクターに基づく遺伝子形質転換:シングルコピー挿入によるトランスジェニック植物作製技術

1.シロイヌナズナ変換

1. シロイヌナズナの植物を形質転換のために準備します。
   1. シロイヌナズナの植物は、花が咲くまで温室または温度制御された成長室で育てます(ディッピングごとにそれぞれ9つの植物を含む12の鉢)。
   2. 最初のボルトをクリップして、より多くのセカンダリボルトが出現できるようにします。植物は、刈り取りの4〜6日後、植物が未熟な花の頭を多く持ち、施肥されたシリックがあまりない場合に浸す準備ができています。
2. フローラルディッピング
   1. 二元細菌人工染色体またはBIBACでクローニングされたT-DNAを運ぶAgrobacterium懸濁液中で5〜10秒間花序を浸します。穏やかに攪拌してください。
   2. 植物の地上部をラップフィルムで包んで湿度を高く保ち、植木鉢を箱で覆って植物を暗く保ちます。植物を温室/成長室で2日間インキュベートします。
   3. 箱とラップフィルムを取り外し、温室/成長室で植物を成熟まで育てます.
      手記：形質転換の効率を高めるために、最初の浸漬から7日後に同じ植物を再浸すことができます。
   4. 種を収穫します。同じ構成物で形質転換した植物の種子(T1)を1つのセットとしてプールして分析します。
3. トランスジェニック植物のスクリーニング。
   1. pBIBAC-RFP-GW誘導体で形質転換したトランスジェニック植物をスクリーニングするには、蛍光顕微鏡を用いて種子を分析します。種皮のDsRed発現を検出するには、560 nmの励起と600〜650 nmの発光で種子を画像化します。鉗子を使用して、蛍光性種子を非蛍光性対応物から分離します。
   2. pBIBAC-BAR-GW誘導体で形質転換したトランスジェニック植物をスクリーニングするには、土壌(~2,500種子/0.1 m²)で満たされたトレイに種子を播種します。トレー上に種子が均一に広がるように、0.5倍Murashige Skoog培地(MS)の0.1%寒天に種子を懸濁し、1mLのピペットを使用して種子を広げます><。 手記：種子が同期して発芽するように刺激するには、種子を4°Cで少なくとも2日間インキュベートします。これは、種を蒔く前または後に行うことができます。
      1. トレイに播種してから2週間後と3週間後に、苗に0.5%グルホシネート-アンモニウム溶液をスプレーします。1 m²あたり500 mLのグルホシネート-アンモニウム溶液を使用します。.
      2. 生き残った苗を個々の鉢に移します。図1に、グルホシネート-アンモニウム処理前(2回目)の苗木を載せたトレイの典型的な画像を示します。
      3. グルホシネート-アンモニウム耐性植物をPCRで分析し、目的のコンストラクトの存在を確認します。
         1. PCRのためにゲノム植物DNAを単離します。

図1:グルホシネート-アンモニウム処理前後のシロイヌナズナの苗を詰めたトレイ。pBIBAC-BAR-GW T-DNAに存在するバー遺伝子を発現していない苗木は、グルホシネート-アンモニウム溶液を噴霧した後に死滅します。写真は、(A)グルホシネート-アンモニウムを散布する前、播種から14日後、(B)10日後に2回散布した後の苗の同じトレイを示しています。