モルフォリノ媒介遺伝子編集:単細胞洞窟魚卵におけるトランスレーショナルブロッキングモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子ノックダウン技術

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. モルフォリノオリゴデザイン

>注:A. mexicanusの配列は、National Center of Biotechnology Information(NCBI)のGeneおよびNCBI SRA(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、およびEnsemblゲノムブラウザ(https://www.ensembl.org)から入手できます。地表と洞窟の両方の形態で使用するモルフォリノを設計する場合、この段階でモルフォリノ間の遺伝的変異を特定することが重要です。これにより、これらの遺伝的領域がモルフォリノの標的として回避されます。モルフォリノ標的部位内の多型変異は、結合の効果を低下させる可能性があります。この設計は、ゼブラフィッシュなどの他の魚類システムと類似しており、以前にA.mexicanusで効果的に機能することが示されています。

1. >翻訳をブロックするモルフォリノスの設計
   手記： 翻訳ブロッキングモルフォリノスは、内因性開始部位に結合することで翻訳をブロックし、立体障害を介して翻訳機構がmRNA配列に結合するのを妨げます.
   1. ATG開始部位から始まる標的遺伝子のコード領域を同定します.
   2. ターゲット配列の最初の25塩基対をテキストエディタまたはラボノートにコピー&ペーストして記録します
   3. オンラインソフトウェア(http://reverse-complement.com など)または手動翻訳を使用して、ターゲット配列の逆補体を生成します。結果の逆補数をテキストエディタまたはラボノートブックに保存します。
   4. モルフォリノオリゴヌクレオチドを生成する会社から、逆補体配列のモルホリノを注文します。企業向けの資料の表を参照してください。

2. マイクロインジェクション

1. 注射用一般ツールの準備
   手記：このセクションの手順については、他の場所で詳しく説明していますが、ここでは小さな変更を加えた概要を示します。
   1. 魚系水に溶解した温かい3%アガロースを100 mLのペトリ皿に注ぐことにより、インジェクションプレートを生成します。注ぎたてのアガロースに卵の注入型を慎重に置き、魚の卵のための井戸を作ります。型の側面を寒天に45°の角度で置き、次にゆっくりとアガロースに下げます。金型を斜めにゆっくりと下げることで、金型の下に空気が閉じ込められるのを防ぎます。アガロースが固まったら、型をそっと取り出します。プレートは、4°Cで最大1週間保管、密封できます。
2. シングルセル期卵子のコレクション
   1. 繁殖が予想される夜は、15〜30分ごとに水槽を調べ、水槽の底に卵がないか監視します。卵は半透明で、直径は約1mmです。
   2. 細かいメッシュの魚網を使用して卵を集め、新鮮な魚のシステムの水で満たされたガラスのボウルに移します。顕微鏡で卵を検査し、卵が1細胞段階にあることを確認します。
   3. ガラスピペットを使用して、単一細胞卵を注入プレートに移します。この段階では、卵がプラスチックにくっつくため、ガラスピペットが必要です。
   4. ピペットを使用して、セクション2.1から卵をアガロース注入プレートのウェルに慎重に放出します。予熱した(室温で)注入プレートの列に最大数の卵(1列あたり30〜40個、最大5列)を入れます。完全な列は、注射中に卵が動くのを防ぐのに役立ちます。注射が終わるまで、少量の魚系水で卵を注射プレートで水和させてください。
3. Pico-injection のセットアップと一般的な注入最適化ガイドライン
   1. キャピラリーの内側に収まるゲルローディングピペットチップを使用するか、標準のマイクロピペットチップを使用して、最後に2〜4μLのボーラスを追加して、注射針を埋め戻します。針がいっぱいになったら、鉗子を使用して注射針の余分な長さを切り取ります。
   2. マイクロマニピュレーターに装着した針をピコリットルマイクロインジェクターに接続してマイクロインジェクションを行います。
   3. 注入時間を 0.03 秒に設定し、圧力アウトを ~0.0 psi に設定します。注入圧力は、針間のわずかな違いに応じて変化するため、~1.0 nL の注入ボーラスが得られるように最適化してください。
      手記：注入圧力は、多くの場合、10~30 psi の範囲です。
   4. 鉱油に注入し、スライドマイクロメータでボーラスサイズを測定することで注入ボーラスを標準化し、~1〜1.5nLの注入量を達成します。注入圧力(psi)を調整して、ボーラス量を増減します。
   5. 実験用ティッシュを使用して、卵の最上部から水を引き出します.
      手記：アストアナックスの卵の絨毛膜は、ゼブラフィッシュの卵よりもわずかに浸透しにくいです。卵の上部から水分を引き出すと、針が卵に浸透しやすくなります。プレートの最適化により、1つのプレートに~200個の卵を収納できます。
   6. マイクロマニピュレーターを使用して、針で各卵子を貫通し、卵黄に直接注入します。卵黄に配置したら、注入ボタンまたは注入フットペダルを押して卵を注入します
      手記：フルプレートは~15分以内に注入できます。シングルセルステージは~40分間続きます。
4. モルフォリノス
   の注入 手記：毒性を引き起こさずにノックダウンするために必要なモルフォリノの量は、遺伝子ターゲットごとに最適化する必要があります。ただし、400 pgの濃度から始めるのが良いでしょう。
   1. 卵1個につき400pgのモルフォリノが注入されるようにモルフォリノを調製します。氷上でモルフォリノを解凍します。注入液は、モルフォリノ(所望の濃度)、RNaseフリーH2Oまたはダニオー溶液、およびフェノールレッド(最終容量の10%)で構成されています。例については、表 1 を参照してください。
   2. 胚ごとに1 nLを注入します。