Tol2トランスポゾン媒介ゼブラフィッシュトランスジェネシス:受精ゼブラフィッシュ胚へのTol2系共注入後のトランスジェニックゼブラフィッシュ作製法

要約

出典:Silic, M. R., et al. Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors. J. Vis. Exp. (2018)

このビデオでは、トランスポゼースmRNAと蛍光電圧インジケーターをコードするTol2トランスポゾンコンストラクトを含むTol2トランスポゾンシステムを同時注入した後、蛍光電圧インジケータータンパク質を構成的に発現する安定したゼブラフィッシュトランスジェニックラインを生成する手順を示します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロインジェクション

1. 注射前の午後に、少なくとも2匹のオスと2匹のメスで4〜6個の繁殖タンクを設置します。これらの魚は午後に餌を与えてはいけません。このステップにより、魚の廃棄物の量が減り、翌朝に魚を片付ける時間を節約するだけでなく、繁殖反応を誘発するのにも役立ちます。
2. 翌朝、(i)ゼブラフィッシュのユビキチンプロモーターと蛍光電位指標遺伝子のAccelerated Sensor of Action Potentials 1(ASAP1)を含むTol2トランスポゾンコンストラクト、および(ii)Tol2 mRNAからなる調製した注射液を-80°C冷凍庫から取り出し、氷上に置きます。
3. 魚の飼育水槽の仕切りを引っ張り、魚が交尾するのを待ちます。一般的に、魚は仕切りを引き抜いてから20〜30分以内に卵を産みます。そうでない場合は、さらに1〜2時間待ちます。魚によっては、まったく卵を産まないこともあります。この場合、魚の胚採取についてこの実験を繰り返します。
4. 待っている間、先端が斜めに折れて鉗子で斜めのエッジを作成するように準備された針があることを確認してください、または繊細なタスクワイパーで折ることによって。
   1. 次のパラメータを使用して、マイクロピペットプーラーのキャピラリーガラスから針を引き抜きます:熱545、プル60、速度80、時間250、圧力500。解剖スコープの下にある鉗子(直径推定用の接眼レンズ定規付き)で針を折る 鉗子を約45°の角度で保持します。所望の針径は、マイクロインジェクターの設定に応じて可変にすることができますが、胚死亡率を減らすためには直径が小さいことが好ましいです。
5. 魚が産卵したら、直径10cmのシャーレに卵を集めて解剖スコープに持って行きます。異常な胚と魚の排泄物をすべて取り除きます。
6. 受精した胚を調製した3%アガロース射出成形金型にピペットで移します。胚を所定の位置に保つために、余分な水分を取り除きます。
7. すべての列が生存可能な胚で満たされたら、単一細胞がすべて針に向かって同じ方向(水平方向に約45°の角度)を向くようにそれらを配置します。これにより、後で注入がはるかに簡単になります。
8. 手袋を着用したまま、20 μLのローディングピペットチップを使用し、調製したコンストラクトの5 μLを氷上のチューブから取り出します。
9. 壊れた毛細管の後端に先端を慎重に挿入し、試薬を先端にできるだけ近づけるように、タッピングを開始する場所まで完全に挿入します。それでも気泡が残っている場合は、先端が折れないように針を振ってください。
10. 針をマイクロインジェクションニードルホルダーに直接挿入し、針が所定の位置に留まるまで慎重に締めます。角度を約45°に調整します。
11. 針を準備して取り付けたら、顕微鏡とガス圧タンクの電源を入れます。商用の_CO2タンクは、一般的にこの目的に適しています。注入量は、保持圧力と排出圧力によって調整されます:保持圧力は約0.5 psi、排出圧力は30 psiです。ペダルを踏むと解決策が出てくることを必ず確認してください。
12. 鉱油を滴下したステージマイクロメータを使用して、溶液の量と流量を直径~150μm(約2nL)に調整します。背圧によって針から少量が滴り落ちることを確認してください。背圧が足りないと、毛細管現象により液体が針に入り、mRNAが破壊されます。
13. 針が較正されたら、受精した胚の単一細胞にコンストラクトを注入し始めます><。 手記：これには、細胞膜が貫通しにくいため、大量の練習、忍耐、および巧妙さが必要です。トランスジェニックゼブラフィッシュを生成するためには、卵黄ではなく細胞に溶液を注入することが重要です。これはモルフォリノ注射とは異なります。コンストラクトが細胞内に入る限り、針がどちら側に細胞に入るかは問題ではありません。トランスジェネシスは、細胞ではなく卵黄に注入した場合、成功率が非常に低くなります。また、シングルセルステージの注入も重要で、そうでなければ体細胞キメラフィッシュが作られます。これにより、導入遺伝子が生殖細胞に入る可能性が低くなります。
14. ゲルノッチの端を使用して、胚を所定の位置に保持し、針が胚を動かさずに圧力を加えることを可能にするバッキングを提供します。針の先端がシングルセルに入ったら、ペダルを踏んで必要な量の溶液を放出します。このプロセスをすべての胚に対して繰り返します。
15. 完了したら、注入した胚をアガロースのノッチから魚系水と使い捨ての3.4mLトランスファーピペットで洗い流し、ラベル付きの皿に移します。胚を28.5°Cのインキュベーターに保管して、成長させます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロースRA	アムレスコ	N605-500G	注射用ゲルを作るため
明視野解剖スコープ	ニコン	SMZの745	デコレーション、マイクロインジェクション、マウント
使い捨てトランスファーピペット3.4ml	サーモサイエンティフィック	午前13-711-9時	魚の胚と水の移動
鉗子#5	WPIの	500342	デコレーションと針の折れ
ローディングのヒント	エッペンドルフ	930001007	注射液を毛細骨針に装填するため
マイクロインジェクション金型	適応科学ツール	TU-1	注入中に魚の胚を保持するためのアガオルス型トレイを準備するには
マイクロインジェクター	WPIの	空圧式ピコポンプ PV820	マイクロインジェクションインジェクター
マイクロマニピュレーター	WPIの	マイクロインジェクター MM3301R	マイクロインジェクション手術
マイクロピペットプーラー	サッター楽器	P-1000	毛細血管針の調製に
鉱油	アムレスコ	J217-500ミリリットル	注入量のキャリブレーション用
プラスチックシャーレ	VWRの	〒25384-088	イメージングプロセス中に魚または魚の胚を保持するため
ステージマイクロメータ	AMスコープ	MR100	マイクロインジェクション容量のキャリブレーション
薄肉ガラスキャピラリー	WPIの	TW100F-4	カッピラリー針を作るための生ガラス