出典:Garone, M. G. et al.PiggyBacベクターを使用したヒト人工多能性幹細胞(iPSC)の機能的な脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換。J. Vis. Exp. (2019年)
このビデオでは、系統特異的転写因子の異所性発現により、PiggyBacトランスポゾンシステムを用いてヒトiPS細胞をトランスフェクションすることにより、運動ニューロンを生成する手順を実演しています。
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方法論記事
ヒトiPS細胞におけるPiggyBacトランスポゾン媒介遺伝子編集:PiggyBacトランスポゾンシステムを用いたヒトiPS細胞への目的遺伝子統合の手順
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
>1. NILおよびNIP誘導性iPS細胞系統の作製
- 細胞トランスフェクション
- 細胞をPBS(Ca2+/Mg2+ free)ですすいでください。
- 細胞解離試薬(材料表を参照)(35 mmディッシュの場合は0.35 mL)を添加し、単一細胞が
- 分離(5〜10分)。
- P1000ピペッターで3〜4回ピペッティングして、細胞分離を穏やかに完了します。
- 15mLのチューブに集め、PBS(Ca2+/Mg2+ free)を10mLに加えます。セルを数えます。
- 106細胞をペレット化し、100 μlのBuffer R(細胞エレクトロポレーションキットに含まれています、材料の表を参照)に再懸濁します。
- トランスフェクション用のプラスミド DNA を添加します: 4.5 μg のトランスポーザブルベクター (epB-Bsd-TT-NIL または epB-Bsd-TT-NIP) と 0.5 μg の piggyBac トランスポゼースプラスミド 。
- セルエレクトロポレーションシステム(材料の表を参照)を使用して、製造元の指示に従って、次のパラメータでトランスフェクションします:1,200 V電圧、30 ms幅、1パルス。10 μM Y-27632(ROCK阻害剤、材料表参照)を添加したヒトiPSC培地に細胞を播種し、6 mmのマトリックスコーティングシャーレにシーディングします。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| B27 | ミルテニーバイオテック | 〒130-093-566 | 神経細胞の維持のための無血清サプリメント |
| バンバンカー | 日本ジェネティクス | NGE-BB02 | 運動ニューロン前駆細胞のための細胞凍結培地 |
| CaCl2 | シグマ・アルドリッチ | C3881 | 電気生理学的溶液用の化学薬品 |
| Corning Matrigel hESC 認定マトリックス | コーニング | 354277 | Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫からの再構成基底膜調製物。iPSCのプラスチックおよびガラス支持体への接着に使用 |
| クライオステム ACF 凍結培地 | バイオ産業 | 05-710-1E | ヒトiPS細胞の凍結培地 |
| ディスパーズ | ギブコ | 17105-041 | ヒトiPS細胞を穏やかに解離するための試薬 |
| DMEM/F12 | シグマ・アルドリッチ | D6421-500ミリリットル | 細胞培養用基礎培地 |
| ドキシサイクリン | シグマ・アルドリッチ | D9891-1Gの | epB-Bsd-TT-NILおよびepB-Bsd-TT-NIPベクターからの導入遺伝子の発現を誘導するために使用 |
| DS2Uの | ウィセル | UWWC1-DS2U | 商用ヒトiPS細胞ライン |
| GDNFの | プレプロテック | 450から10 | グリア由来神経栄養因子 |
| Gibco Episomal hiPSC ライン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A18945の | 商用ヒトiPS細胞ライン |
| ヘペス | シグマ・アルドリッチ | H4034-J | 電気生理学的溶液用の化学薬品 |
| ラミニン | シグマ・アルドリッチ | 11243217001 | in vitroで神経細胞の接着と増殖を促進する |
| NEAAの | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11140035 | 非必須アミノ酸。細胞増殖と生存率を高めるために、細胞培養培地のサプリメントとして使用されます。 |
| ネオン100μLキット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MPK10096 | 細胞エレクトロポレーションキット |
| ネオントランスフェクションシステム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | MPK5000 | 細胞エレクトロポレーションシステム |
| ニューロベースルミディアム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21103049 | アストロサイトフィーダー層を必要とせずに、ニューロン細胞集団の長期維持と成熟のために設計された基礎培地 |
| ニュートリステム-XF/FF | バイオ産業 | 05-100-1A | ヒトiPS細胞培地 |
| PBS Ca2+/Mg2+ フリー | シグマ・アルドリッチ | ド8537-500ML | ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、カルシウムなし、マグネシウムなし |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | シグマ・アルドリッチ | 4333-100ミリリットル | 細菌による細胞培養汚染を防止するために用いられるペニシリン/ストレプトマイシン溶液です。 |
| Y-27632(ROCK阻害剤) | エンツォライフサイエンス | ALX-270-333-M005 | Rho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ(ROCK)の細胞透過性選択的阻害剤。iPS細胞の生存率を向上 |
