画像誘導ロボット細胞マイクロインジェクション:器官型脳スライス培養における単一ニューロン細胞への蛍光標識多糖類の精密送達のための自動ハイスループット技術

要約

出典: Shull, G. et al. Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、オートインジェクターを使用して、マウス胚脳の器官型スライスの錐体ニューロンに蛍光標識多糖類のロボットマイクロインジェクションを実演します。オートインジェクターは、顕微鏡から取得した画像を利用して、目的の生体分子を単一細胞に正確に送達するロボットプラットフォームです。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ソフトウェアのインストール

1. 指示に従って、https://github.com/bsbrl/Autoinjector からソフトウェアをインストールします。

2. 試薬とピペットの準備

1. アガロース:2つの別々の200 mLガラス瓶に、3 gの広範囲アガロースと3 gの低融点アガロースを100 mLの細胞培養グレードPBSにそれぞれ別々に溶解して、3%アガロースを調製します。室温で最大3か月間保存してください。
2. チロード溶液:重炭酸ナトリウム1 gとチロード塩(ボトル全体の含有量を使用)と13 mLの1 M HEPESを1 Lの蒸留水に溶解します。pHを7.4に調整します。0.2 μmのボトルトップフィルターで溶液をろ過します。
3. スライス培地(SCM):ラット血清10 mL、2 mMグルタミン1 mL、ペニシリン-ストレプトマイシン1 mL(100倍)、N-2サプリメント1 mL(100倍)、B27サプリメント2 mL(50倍)、HEPES(pH 7.3)緩衝液1 mLを84 mLの神経基礎培地に加えます。5 mLのSCMを15 mLチューブに分注します。.-20°Cで保存してください。
4. CO_{2-Independent} Microinjection Medium(CIMM):粉末を200 mLの蒸留水に溶解して、5x DMEM修飾低グルコース溶液(フェノールレッドなし)を調製します。0.2 μmのボトルトップフィルターで溶液をろ過します(DMEMパウダーの場合は、ボトル全体の内容物を使用します)。100 mLのCIMMを調製するには、20 mLの5x DMEM改変溶液、1 mLのHEPES緩衝液、1 mLのN2サプリメント(100倍)、2 mLのB27サプリメント(50倍)、1 mLのペニシリン-ストレプトマイシン(100倍)、1 mLの2 mMグルタミン、および74 mLの蒸留水を混合します。溶液は4°Cで保存します。
5. 再構成バッファー:262 mM NaHCO₃、0.05 N NaOH、200 mM HEPESを蒸留水に溶解して、再構成バッファーを調製します。ボトルトップ0.22μmフィルターシステムを介してろ過することにより、溶液を滅菌ガラスボトルに滅菌します。500 μLの再溶解バッファーを気密性マイクロ遠心チューブに分注します。4°Cで保存してください。
6. マイクロインジェクション色素ストック:蛍光標識したデキストランをRNase遊離蒸留水(最終濃度10 μg/μL)に溶解します。5 μLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
7. マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリー(外径1.2 mm、内径0.94 mm)からマイクロインジェクションピペットを引き出します。ピペットをほこりから保護します。ピペットは2〜3日以上保管しないでください。この実験では、引っ張るパラメータはHEAT:ランプ温度+ 1 – 5でした。プル:100;VEL:110;デル:100。HEATとVELは、ピペットの形状とサイズに最も影響を与えるパラメータです。
   手記：最適なマイクロインジェクションピペットは、マイクロインジェクション中の細胞損傷を避けるために、長くて柔軟な先端を備えています。

>3. ティッシュスライスの準備

1. 脳組織解剖の前に、電子レンジを使用して3%広範囲アガロースを溶かします。埋め込む前に37°Cのウォーターバスに保管してアガロースを固めないでください。ピペットがほこりから保護されていることを確認してください。ピペットは2〜3日以上保管しないでください。
2. SCMのアリコートを解凍し、10〜12 mLのCIMMと20 mLのTyrode溶液をウォーターバスを使用して37°Cに温めます。
3. 蛍光トレーサー(Dextran-3000またはDextran-10000-Alexa結合、最終濃度5〜10 μg/μL)を注入する他の化学物質と混合します。マイクロインジェクション溶液を16, 000 x gで4°Cで30分間遠心分離し、上清を収集して新しいチューブに移します。マイクロインジェクション溶液は、使用するまで氷の上に置いてください。
4. E13.5–E16.5マウス胚の頭部を使用して、終脳の器官型組織スライスを調製します。皮膚を取り除き、鉗子を使用して頭蓋骨を開き、正中線に沿って移動します。開いた頭蓋骨から胚の脳を解剖し、脳の腹側から始めて脳組織を覆っている髄膜を取り除きます。解剖した全脳を37°Cの加熱ブロック上のTyrodeの溶液に残します><。 手記：3.4に記載されているすべての解剖手順は、予熱したTyrode溶液で実行する必要があります。
5. 広範囲に溶かしたアガロースを使い捨ての埋め込み型に流し込みます。アガロースを38〜39°Cに冷却したら、パスツールピペットを使用して脳(最大4個)を慎重に移します。このステップでは、常にカットチップを使用してください。
6. 組織に触れずに、へらまたはデュモン#1鉗子のペアを使用して、組織の周りでアガロースをかき混ぜます。アガロースを室温で固めます。アガロースが固まったら、組織を囲む余分なアガロースをトリミングします。
7. バッファトレイにPBSを充填します。組織の吻尾軸をトレイに垂直にして脳を向けます(脳の吻側最上部を表す嗅球を目印として使用します)。250μmのスライスをビブラトームでカットします。
8. 3.5cmのシャーレに2mLの温めた培地を入れます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、スライス(10〜15)をこの皿に移します。完了したら、スライスしたペトリ皿をスライス培養インキュベーターに移します。スライスは、使用まで40%O₂ / 5%CO₂ / 55%N₂を含む加湿雰囲気で37°Cに維持します。

>4. マイクロインジェクション

1. コンピューター、顕微鏡、顕微鏡カメラ、マニピュレーター、圧力リグ、圧力センサーの電源を入れます。GitHubからダウンロードしたメインフォルダ内のファイル「launchapp.py」をクリックしてアプリケーションをロードし、ポップアップ画面でデバイス設定を指定します(インストール手順については手順1.1を参照してください)。
2. ピペットを溶液に浸す前に、不要な目詰まりを防ぐために外向きの圧力をかけてください。ピペットに圧力を加えるには、補正圧力バーを24〜45%にスライドさせ、[値の設定]をクリックします。次に、圧力センサーが示すように、機械式圧力バルブノブを1〜2 PSI(69〜138 mbar)に回して、圧力を十分な圧力に調整します。
3. スライスを、2mLの予熱済みCIMMが入った3.5cmのシャーレに移します。マイクロインジェクションするスライスをペトリ皿の中央に置きます。ペトリ皿を予熱した(37°C)マイクロインジェクションステージに移します。
4. 先端の長いプラスチックピペットを使用して、1.4〜1.6 μLのマイクロインジェクション溶液(ステップ3.3から)をマイクロインジェクションピペットにロードします。マイクロインジェクションピペットをピペットホルダーに挿入します。
5. 顕微鏡で最低の倍率を使用して、スライスに焦点を合わせ、マイクロピペットをこの視野(FOV)に誘導して、スライスターゲットと同じ平面に焦点を合わせます。顕微鏡の出力をカメラに切り替えて、アプリケーションでFOVを確認します。
6. インターフェースの左上にある倍率ボタンをクリックして、デバイスのキャリブレーションを開始します。ウィンドウが表示され、倍率を選択するように求められます。10倍の倍率、またはレンズに設定されている倍率(4倍、10倍、20倍、40倍など)を選択し、[OK]を押します。ソフトウェアは、内部の対物レンズが10倍(最も一般的な対物レンズの倍率)であると仮定しています。
7. 顕微鏡のマイクロメトリックホイールを使用してピペットチップの焦点を合わせ直し、カーソルでピペットチップをクリックします。次に、ステップ1.1ボタンを押して、ポップアップウィンドウでOKを押します。ピペットはY方向に移動します。ピペットの先端をクリックし、ステップ1.2ボタンを押します。最後に、ピペット角度ボックスに45を入力し、角度の設定を押します。
8. 自動マイクロインジェクションコントロールパネルに必要なパラメータを入力します。頂端前駆細胞へのマイクロインジェクションの場合、注入距離を20〜40μmに、深さを10〜15μmに設定します。ニューロンへのマイクロインジェクションの場合、注入距離は基底側から30〜40μm、深度はターゲットに応じて10〜30μmに設定します。速度は常に100%に設定してください。[Set values.
   ] をクリックします。 手記：アプローチ距離は、ピペットが次の注入距離に移動する前に組織から引き出す距離、深さはマイクロインジェクションが進む組織への深さ、間隔はシーケンシャルインジェクション間のラインに沿った距離、速度はピペットの速度(μm/s)です。
9. [エッジの描画]ボタンをクリックし、ポップアップ ウィンドウで目的の軌道に沿ってカーソルをドラッグして、注入の軌道を定義します。前駆幹細胞のマイクロインジェクションでは、終脳表面の腹側が標的となります。ピペットをラインの先頭に持ってきて、ピペットの先端をクリックします。「軌道を実行」をクリックして、マイクロインジェクションを開始します。ターゲットとする射出の各平面に対してこの手順を繰り返します(通常は、平面ごとに 40 〜 75 回の射出を行う 3 〜 4 平面に対して行われます)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
化学薬品
アガロース、ローメルト	カール・ロス	カタログ番号# 6351.2
アガロース、ワイルドレンジ	シグマ・アルドリッチ	カタログ番号# A2790
ベスト-CA 221グルー	ベストKlebstoffe GmbH & Co.KG	ネコ# CA221-10ml
B-27 サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Cat# 17504044
蒸留水
DMEM-F12、CO2非依存(フェノールレッドなし)	シグマ・アルドリッチ	カタログ番号# D2906
DMEM-F12、CO2非依存(フェノールレッド付き)	シグマ・アルドリッチ	カタログ番号# D8900
HEPES-NAOH、pH 7.2、1M(HEPESバッファー)	カール・ロス	カタログ番号# 9105.3
L-グルタミン、200 mM	サーモフィッシャー Sientific	猫#25030024
モヴィオール4-88	シグマ・アルドリッチ	カタログ番号# 81381
N-2サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Cat# 17502048
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Cat# 21103049
ヌクレアーゼフリー水	サーモフィッシャーサイエンティフィック	カタログ番号# AM9937
O2(40%)、CO2(5%)、N2(55%)ミックス、50リットル
PBSの
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Cat# 15140122
ラット血清	チャールズリバー研究所
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	メルク	Cat# 106323
水酸化ナトリウム(NaOH)	メルク	Cat# 106482
タイロードの塩	シグマ	Cat#T2145-10x1L)
備品
ホウケイ酸ガラスキャピラリー、外径1.2mm×内径0.94mm	サッターインストゥルメント	カタログ番号 BF-120-94-10
ボトルトップフィルターシステム、500 mL	コーニング	Cat# 430769
コンピューターPC
カスタム圧力リグ		カスタム圧力リグ
電子式圧力調整器	パーカー・ハネフィン	カタログ番号# 990-005101-002
ファルコンチューブ、15 mL	コーニング	Cat# 430791
ファルコンチューブ、50 mL	コーニング	Cat# 430829
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	ネコ# P-97
鉗子、デュモン号3	ファインサイエンスツール	カタログ番号# 11231-30
鉗子、デュモン第5号	ファインサイエンスツール	カタログ番号# 11255-20
鉗子、デュモン No. 55	ファインサイエンスツール	カタログ番号# 11252-20
ヒーティングブロック	ラボテックインターナショナル	ネコ #ドリブロック Digi2
倒立型蛍光顕微鏡	ツァイス	Cat# Axiovert 200
光源	オリンポス	Cat# ハイライト 3100
手動式圧力調整器	マクマスター・カー	カテゴリ# 0-60 PSI 41795K3
マイクロローダーのヒント	エッペンドルフ	カタログ番号# 5242956.003
マイクロコントローラ	Arduinoの	Cat# Arduinoの期限
顕微鏡カメラ 浜松 オルカ Flash 4.0 V3
顕微鏡用電動ステージ XY
パスツール・ピペット、プラスチック
ペトリ皿, 60 x 15 mm	グライナー	Cat# 628102
ペトリ皿、35 x 10 mm	ヌンク	Cat# 153066
シャーレ、34 x 14 mm、Microwell No. 1.5カバーガラスを含む	マテック	カタログ番号#P35G-1.5-14-C
ピペットホルダー	ワーナー・インストゥルメンツ	カタログ番号# 64-2354 MP-s12u
ピペットとヒント
プーラーフィラメント、3.0mm角ボックスフィラメント	サッターインストゥルメント	カタログ# FB330B
スライス培養インキュベーションボックス	MPI-CBGの	Cat#カスタムメイド
ソレノイドバルブ	Cat# LHDA053321H-A
卓上遠心分離機	ヘレウス	Cat# 5431622
温度計
3軸マニピュレーター	Sensapex株式会社	Cat# ツリー軸 uMP
ビブラトーム	ライカ	Cat# VT1000番台
全胚培養システムインキュベーター	イケモトカンパニー	カタログ番号# RKI-10-0310
ウォーターバス
ソフトウェアとアルゴリズム
Arduinoの	Arduinoの
フィジー	RRID番号: SCR_002285
ニシキヘビ	Pythonソフトウェア基盤	Pythonの2.7.12
禅		RRIDの番号:SCR_013672