親水性相互作用液体クロマトグラフィー:親水性ビーズを用いた親水性極性分析種を分離する技術

要約

出典:Liu, D., et al. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (2020年)。

このビデオでは、親水性相互作用液体クロマトグラフィーを使用して親水性極性化合物を分離する原理を示しています。この手法は、N型糖鎖を含むさまざまな極性分析種の精製に役立ちます。

プロトコル

1. 親水性相互作用クロマトグラフィーと糖鎖分析

1. UPLC装置のコンディショニングと移動相の調製
   1. 溶媒 A:100 mM ギ酸アンモニウム(pH = 4.4)、溶媒 B:100% アセトニトリル、溶媒 C:90% 超純水(10% メタノール)、溶媒 D:50% メタノール(超純水)を含む移動相を調製します。
   2. ソフトウェアを開いて移動相を制御します。
   3. UPLC 装置を 0.2 mL/分(50% 溶媒 B と 50% 溶媒 C)の流速で 30 分間バランスを取り、次に 0.2 mL/分(25% 溶媒 A と 75% 溶媒 B)の流速で 20 分間バランスを取り、その後 0.4 mL/分の流速でバランスを取ります。
2. 2-アミノベンズアミド(2-AB)で標識済みのN型糖鎖を、100%アセトニトリルと超純水の混合物25 μLに2:1の比率(v/v)で溶解します。次に、134 μ g× gで5分間(4°C)遠心分離し、標識したN型糖鎖10 μLをUPLC装置にロードします。
3. 標識 N 型糖鎖を 0.4 mL/分の流速で分離し、75% から 62% アセトニトリルの線形グラジエントで 25 分間分離します。次に、デキストランキャリブレーションラダー/グリコペプチドカラムを用いて、UPLC で 60 °C で分析分析を行います(ここでは、サンプルを注入前に 4 °C に保持しています)。
4. 励起波長330 nmおよび発光波長420 nmでN型糖鎖蛍光を検出します。
5. ピーク位置と保持時間に基づいて糖鎖を波形解析します。
6. 各糖鎖ピーク(GP)/全糖鎖ピーク(GP)の相対値(パーセンテージ、%)をGP1:GP1/GPs*100、GP2:GP2/GPs*100、GP3:GP3/GPs*100などで算出します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-アミノベンズアミド、2-AB	Sigma, 中国
アセトニ トリル	Huihai Keyi Technology Co.、Ltd、中国
ギ酸アンモニウム	北京Minruida技術有限公司
デキストランキャリブレーションラダー/グリコペプチドカラム	ワッツテクノロジー株式会社、中国
エンパワー3.0	Waters technology Co., Ltd, アメリカ
GlycoProfile 2-AB ラベリングキット	Sigma, 中国
メタノール	Huihai Keyi Technology Co.、Ltd、中国
Milli-Q純水メーター	Millipore Co., Ltd, アメリカ	202-2AB
トランスファーリキッドガン	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, 中国	アドバンテージA10
超低温冷凍機	Thermo Co., Ltd, アメリカ	PB-10
超高速液体クロマトグラフィー	ワッツテクノロジー株式会社、中国
真空ポンプ	ワッツテクノロジー株式会社、中国	4672100、0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl