逆相高速液体クロマトグラフィー:マウス肝臓から単離された蛍光標識および誘導体化シアル酸の定量のための頑健な分析法(英語)

Abstract

出典:Cao, C. et al. 野生型およびCMAHノックアウトマウスの肝臓および牛乳サンプル中のシアル酸の測定。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、高速液体クロマトグラフィー、HPLCを使用して、蛍光検出を支援するための適切な蛍光標識試薬による誘導体化後のシアル酸、N-アセチルノイラミン酸、およびN-グリコリルノイラミン酸の検出を実演します。

Protocol

1. シアル酸の蛍光誘導体化

1. 10 mLの蒸留H₂Oに100 mgのo-フェニレンジアミンと208 mgの亜硫酸ナトリウムからなる10 mLのOPD溶液を調製します。
2. 20 μLのOPD溶液をシアル酸サンプルに加えます。30秒間激しくボルテックスし、暗所で80°Cで4時間サンプルをインキュベートします(つまり、マイクロチューブをアルミホイルで包みます)。
3. サンプルを5分間冷まし、蒸留H₂O80 μLを加え、チューブを14,000 x gで1分間遠心分離します。
4. 上清から80 μLを300 μLの高回収HPLCバイアルに移します。誘導体化されたシアル酸サンプルは、4〜6°Cで最大1週間保存できます。

2. シアル酸誘導体のHPLC分析

1. オンライン蛍光検出器に接続された標準的なHPLCシステムを使用してサンプルを分析します。
2. 分析には、長さ250 mm、直径4.6 mmの標準寸法の逆相C18カラムを使用します。
3. 溶媒Aは、200 mLのストック溶液を800 mLのLCMSグレードの水で希釈して調製します(LCMS - 液体クロマトグラフィー質量分析)。ストック溶液自体は、次のように調製できます。
   1. 46 g のギ酸を 800 mL の LCMS グレードの H₂O に加えます。
   2. 水酸化アンモニウム溶液(puriss.p.a.)を滴下してpHを4.5に調整します。
   3. 溶媒を測定シリンダーに移し、LCMSグレードのH₂Oを最大1,000mL充填します。このストック溶液は、4〜6°Cで最大3ヶ月間保存できます。
4. 溶媒Bには、LCMSグレードのアセトニトリルを使用してください。
5. シアル酸誘導体を 1 mL/分の流速で分離し、以下のグラジエント溶出を行います。
   1. まず、溶媒Aに混合した溶媒Bを10%加えます。
   2. 0分から15分まで、線状グラジエントを持つ溶媒Bの割合を徐々に60%まで増やします。
   3. 15分から16分まで、線状グラジエントを持つ溶媒Bの割合を60%から90%まで急速に増やします。これにより、HPLCカラムの洗浄が開始されます。
   4. HPLCカラムをさらに洗浄するには、16分から18分の間に溶媒Bのレベルを90%に保ち、18分から19分の間に溶媒Bのレベルを再び10%に徐々に下げます。
   5. HPLCカラムを10% Bの開始条件まで19分から24分の間に再平衡化します。
6. 50 μLのサンプルをHPLCシステムに注入します。
7. 蛍光検出器の励起/発光波長373/448 nmを用いて溶離液をモニターすると、誘導体化されたシアル酸の保持時間は、Neu5Gc-OPDの場合9分、Neu5Ac-OPDの場合10分程度のおよその保持時間が期待できます。
8. Neu5Ac (A_Neu5Ac) と Neu5Gc (A_Neu5Gc) の蛍光ピーク面積から、Neu5Gc (F_Neu5Gc) の相対量を次のように算出します
   f_neu5Gc [%] = 100×A_Neu5Gc /(A_Neu5Ac+A_Neu5Gc)。ホモ接合型Cmahノックアウトマウスのミルクと肝臓のサンプルの場合、F_Neu5Gcは0%であるべきですが、ヘテロ接合型および野生型マウスのF_Neu5Gcの値は、マウスの年齢と組織タイプ(2%から>90%)によって大きく異なり、予想される誤差マージンは±12%です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
化学薬品
N-アセチルノイラミン酸	シグマ	A0812 (英語)
N-グリコリルノイラミン酸	シグマ	50644	1 mgのアリコートで十分です
O-フェニレンジアミン	シグマ	694975
亜硫酸水素ナトリウム	J&Kサイエンティフィック・リミテッド	75234
HPLC分析
高回収HPLCバイアル	アジレント・テクノロジーズ	#5188-2788
HPLCシステム	島津製作	ネクセラ
HPLC用蛍光検出器	島津製作	RF-20アックス
HPLCカラム	フェノメネックス	ハイパークローンODS	250 x 4.6ミリメートル
LCMSグレードH2O	メルクミリポア	#WX00011
LCMSグレードのアセトニトリル	メルクミリポア	#100029	ハイパーグレード
水酸化アンモニウム溶液	フルーカ	#44273	ピューリス p.a.